Ｐａｉ−１機能の治療的阻害因子およびその使用法

专利摘要:
本発明は、哺乳動物PAI-1リガンドおよびモジュレータに関する。特に、本発明は、PAI-1のリガンドおよび／またはモジュレータであるポリペプチド、ポリペプチド組成物、およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、PAI-1活性をモジュレートするホモポリリガンドまたはヘテロポリリガンドであるポリリガンドにも関する。本発明はまた、細胞の領域に局在するリガンドおよびポリリガンドにも関する。本発明はまた、PAI-1リガンドおよびポリリガンドの空間的制御を提供するために用いることができる局在化テザーおよびプロモーター配列にも関する。本発明はまた、PAI-1リガンドおよびポリリガンドの時間的制御を提供するために用いることができる誘導型遺伝子スイッチにも関する。本発明はまた、アテローム性動脈硬化症を処置または予防する方法にも関する。本発明はまた、線維症を処置または予防する方法にも関する。
公开号:JP2011509093A
申请号:JP2010542283
申请日:2009-01-09
公开日:2011-03-24
发明作者:ジョナサン カーソン；エレナ タシェバ；リチャード；イー． ピーターソン；キャサリン；エル． ベアー；ジョーン；ソプツィンスキ マッツァレリ；ベサニー；エル． メレニック；チャールズ；シー． リード；トーマス；ディー． リード
申请人:イントレキソン コーポレーション；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 発明の分野
本発明は、改変PAI-1タンパク質および核酸に関する。本発明はまた、哺乳動物のPAI-1リガンドおよびモジュレータにも関する。特に、本発明は、PAI-1のリガンドおよび／またはモジュレータであるポリペプチド、ポリペプチド組成物、およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、PAI-1活性をモジュレートするホモポリリガンドまたはヘテロポリリガンドであるポリリガンドにも関する。本発明はまた、細胞の領域に局在するリガンドおよびポリリガンドにも関する。本発明はまた、PAI-1リガンドおよびポリリガンドの空間的制御を提供するために用いることができる局在化テザーおよびプロモーター配列にも関する。本発明はまた、PAI-1リガンドおよびポリリガンドの時間的制御を提供するために用いることができる誘導型遺伝子スイッチにも関する。本発明はまた、アテローム性動脈硬化症を処置または予防する方法にも関する。本発明はまた、線維症を処置または予防する方法にも関する。]
背景技術

[0002] 発明の背景
プラスミノーゲン活性化因子阻害因子-1（PAI-1）は、プロ酵素であるプラスミノーゲンを線維溶解酵素であるプラスミンに変換する物質である、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（uPA）のセリンプロテアーゼ阻害因子である。PAI-1による線維素溶解の調節は、フィブリンが蓄積すると血液凝固が起こりうるものの過度にフィブリンが減少すると出血に至りうることから、正常な血管機能にとって重要な制御点である。PAI-1はまた、マトリクスメタロプロテナーゼのみならずプラスミン生成を不活化することによって組織線維症において重要な役割を果たし（Takeshita, K, et al., American Journal of Physiology, 2004(2):449-456（非特許文献1））、動物モデルにおいてPAI-1発現をモジュレートする研究は、化学物質または免疫媒介損傷後の線維症の病因にPAI-1が関係していることを暗示した（Weisberg. AD et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2005, 25:365-371（非特許文献2））。]
[0003] PAI-1はまた、腎、肺、心血管、および代謝疾患（Cale, JM and Lawrence, DA. Curr Drug Targets, 2007, 8(9):971-81（非特許文献3））のみならず癌の病理生理学にも関係している。多くの試験が、心疾患の発症におけるPAI-1の役割を支持している。たとえば、PAI-1を薬理学的に阻害すると、アンジオテンシン-II誘導大動脈リモデリングに対して保護することが証明された（Weisberg. AD et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2005, 25:365-371（非特許文献2））。さらに、心筋梗塞後のPAI-1欠損マウスにおいて、野生型と比較して心線維症発症の減弱が観察された（Takesita, K, et al., American Journal of Pathology, 2004, 164(2):449-455（非特許文献4））。いくつかの研究（Sobel, BE et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2003, 23:1979-1989（非特許文献5）における論評）は、血管壁におけるPAI-1の発現の変更が冠動脈アテローム発生に関与する可能性があることを示唆している。]
[0004] 心臓においてPAI-1発現を操作するための新しい試薬および方法は、心疾患におけるその役割に対する研究を進展させるであろう。さらに、PAI-1活性を阻害するための新規試薬、処置、および方法がこの領域において必要である。]
先行技術

[0005] Takeshita, K, et al., American Journal of Physiology, 2004(2):449-456
Weisberg. AD et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2005, 25:365-371
Cale, JM and Lawrence, DA. Curr Drug Targets, 2007, 8(9):971-81
Takesita, K, et al., American Journal of Pathology, 2004, 164(2):449-455
Sobel, BE et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2003, 23:1979-1989]
[0006] 発明の概要
本発明の1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを提供することである。]
[0007] 本発明のもう1つの目的は、局在化テザーに連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを提供することである。]
[0008] 本発明のもう1つの目的は、組織特異的プロモーターに連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを提供することである。]
[0009] 本発明のもう1つの目的は、誘導型遺伝子スイッチに連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを提供することである。]
[0010] 本発明のもう1つの目的は、リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを局在化テザーまたは組織特異的プロモーターに連結させることによって、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータの空間的制御を達成する方法を提供することである。]
[0011] 本発明のもう1つの目的は、リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを誘導型遺伝子スイッチに連結させることによって、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータの時間的制御を達成する方法を提供することである。]
[0012] 本発明のもう1つの目的は、空間的制御を提供するために、PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータと共に用いることができる局在化テザーを提供することである。]
[0013] 本発明のもう1つの目的は、空間的制御を提供するために、PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータと共に用いることができる組織特異的プロモーターを提供することである。]
[0014] 本発明のもう1つの目的は、時間的制御を提供するためにPAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータと共に用いることができる誘導型遺伝子スイッチを提供することである。]
[0015] 本発明のもう1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを提供することである。]
[0016] 本発明のもう1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドと、局在化テザーまたは組織特異的プロモーターとを含む遺伝子構築物を提供することである。]
[0017] 本発明のもう1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。]
[0018] 本発明のもう1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供することである。]
[0019] 本発明のもう1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック生物を提供することである。]
[0020] 本発明のもう1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを用いて心血管疾患を処置または予防する方法を提供することである。]
[0021] 本発明のもう1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを用いて線維症状態を処置または予防する方法を提供することである。]
[0022] 本発明のもう1つの目的は、PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを心血管組織に移入するための方法である。]
[0023] 本発明のもう1つの態様は、不安定プラークの形成におけるPAI-1の機能を査定するための方法を提供することである。]
[0024] 本発明のもう1つの目的は、繊維素溶解経路の阻害因子を発現するように改変された単球を用いてアテローム性動脈硬化症を処置または予防する方法を提供することである。]
[0025] 本発明のもう1つの目的は、繊維素溶解経路の阻害因子を発現するように改変された単球を用いて線維症状態を処置または予防する方法を提供することである。]
[0026] 本発明のもう1つの目的は、デグロンに連結したPAI-1タンパク質を含む融合タンパク質を提供することである。]
[0027] 本発明のもう1つの目的は、局在化シグナルに連結したPAI-1を含む融合タンパク質を提供することである。]
[0028] 本発明のもう1つの目的は、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を提供することである。]
[0029] 本発明のもう1つの目的は、デグロンをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を提供することである。]
[0030] 本発明のもう1つの目的は、局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を提供することである。]
[0031] 本発明のもう1つの目的は、デグロンおよび／または局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構築物を提供することである。]
[0032] 本発明のもう1つの目的は、デグロンおよび／または局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構築物を含有するベクターを提供することである。]
[0033] 本発明のもう1つの目的は、デグロンおよび／または局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構築物を含有するベクターを含有する宿主細胞を提供することである。]
[0034] 本発明のもう1つの目的は、デグロンおよび／または局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック生物を提供することである。]
[0035] 本発明のもう1つの目的は、遍在性、組織特異的、細胞特異的、または誘導型プロモーターが含まれる、デグロンおよび／または局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構築物を提供することである。]
[0036] 本発明のもう1つの目的は、遍在性、組織特異的、細胞特異的、または誘導型プロモーターが含まれる、デグロンおよび／または局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構築物を含有するベクターを提供することである。]
[0037] 本発明のもう1つの目的は、遍在性、組織特異的、細胞特異的、または誘導型プロモーターが含まれる、デグロンおよび／または局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構築物を含有するベクターを含有する宿主細胞を提供することである。]
[0038] 本発明のもう1つの目的は、遍在性、組織特異的、細胞特異的、または誘導型プロモーターが含まれる、デグロンおよび／または局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列に任意で連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構築物を含有するトランスジェニック生物を提供することである。]
[0039] 本発明のもう1つの目的は、宿主細胞におけるPAI-1の発現を変更させる方法を提供することである。]
[0040] 本発明のもう1つの目的は、心組織におけるPAI-1の発現を変更させる方法を提供することである。]
[0041] 本発明のもう1つの目的は、変更されたPAI-1発現を有するトランスジェニック被験体を作製する方法を提供することである。]
[0042] 本発明のもう1つの目的は、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを提供することである。]
[0043] 本発明のもう1つの目的は、デグロンに連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを提供することである。]
[0044] 本発明のもう1つの目的は、局在化シグナルに連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータを提供することである。]
[0045] 本発明のもう1つの目的は、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを提供することである。]
[0046] 本発明のもう1つの目的は、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子構築物を提供することである。]
[0047] 本発明のもう1つの目的は、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子構築物を含有するベクターを提供することである。]
[0048] 本発明のもう1つの目的は、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子構築物を含有するベクターを含有する宿主細胞を提供することである。]
[0049] 本発明のもう1つの目的は、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック生物を提供することである。]
[0050] 本発明のもう1つの目的は、遍在性、組織特異的、細胞特異的、または誘導型プロモーターが含まれる、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子構築物を提供することである。]
[0051] 本発明のもう1つの目的は、遍在性、組織特異的、細胞特異的、または誘導型プロモーターが含まれる、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子構築物を含有するベクターを提供することである。]
[0052] 本発明のもう1つの目的は、遍在性、組織特異的、細胞特異的、または誘導型プロモーターが含まれる、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子構築物を含有するベクターを含有する宿主細胞を提供することである。]
[0053] 本発明のもう1つの目的は、遍在性、組織特異的、細胞特異的、または誘導型プロモーターが含まれる、エピトープ、レポーター、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結した、哺乳動物PAI-1リガンド、ポリリガンド、および／またはモジュレータをコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子構築物を含有するトランスジェニック生物を提供することである。]
[0054] 本発明のもう1つの目的は、宿主細胞においてPAI-1を阻害する方法を提供することである。]
[0055] 本発明のもう1つの目的は、心組織においてPAI-1を阻害する方法を提供することである。]
[0056] 本発明のもう1つの目的は、低減されたPAI-1活性を有するトランスジェニック被験体を作製する方法を提供することである。]
[0057] ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の説明
SEQID NO:1〜30は、PAI-1リガンドおよびポリリガンド、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドの例を表す。その個々のペプチド成分の構成を示す以下のリガンドおよびポリリガンドの各々のダイアグラムを図9に示す。]
[0058] 具体的に、SEQID NO:1のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:2によってコードされる。SEQ ID NO:1のPAI-1ポリリガンドは、ホモポリリガンドの態様であり、本明細書においてPAI1-DCY-94-1として知られる。]
[0059] SEQID NO:3のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:4によってコードされる。SEQ ID NO:3のPAI-1ポリリガンドは、モノマーリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-2としても知られる。]
[0060] SEQID NO:5のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:6によってコードされる。SEQ ID NO:5のPAI-1ポリリガンドは、ホモポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-3としても知られる。]
[0061] SEQID NO:7のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:8によってコードされる。SEQ ID NO:7のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-4としても知られる。]
[0062] SEQID NO:9のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:10によってコードされる。SEQ ID NO:9のPAI-1ポリリガンドは、モノマーリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-5としても知られる。]
[0063] SEQID NO:11のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:12によってコードされる。SEQ ID NO:11のPAI-1ポリリガンドは、モノマーリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-6としても知られる。]
[0064] SEQID NO:13のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:14によってコードされる。SEQ ID NO:13のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-7としても知られる。]
[0065] SEQID NO:15のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:16によってコードされる。SEQ ID NO:15のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-8としても知られる。]
[0066] SEQID NO:17のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:18によってコードされる。SEQ ID NO:17のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-9としても知られる。]
[0067] SEQID NO:19のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:20によってコードされる。SEQ ID NO:19のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-10としても知られる。]
[0068] SEQID NO:21のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:22によってコードされる。SEQ ID NO:21のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-11としても知られる。]
[0069] SEQID NO:23のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:24によってコードされる。SEQ ID NO:23のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-12としても知られる。]
[0070] SEQID NO:25のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:26によってコードされる。SEQ ID NO:25のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-13としても知られる。]
[0071] SEQID NO:27のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:28によってコードされる。SEQ ID NO:27のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-14としても知られる。]
[0072] SEQID NO:29のPAI-1ポリリガンドは、そのコドンが哺乳動物発現およびベクター挿入に関して最適化されているSEQ ID NO:30によってコードされる。SEQ ID NO:29のPAI-1ポリリガンドは、ヘテロポリリガンドの態様であり、同様に本明細書においてPAI1-DCY-94-15としても知られる。]
[0073] SEQID NO:31〜36は、リガンドおよびポリリガンドを構築するために用いられる完全長のタンパク質の例を表す。SEQ ID NO:31は、ヒト（Homo sapiens）プラスミノーゲン活性化因子阻害因子1として知られ、公的なアクセッション番号AAA60009を有する。SEQ ID NO:32は、ヒトビトロネクチンとして知られ、公的なアクセッション番号EAW51082を有する。SEQ ID NO:33は、ヒトカリクレイン2、前立腺イソ型1として知られ、公的なアクセッション番号NP_005542を有する。SEQ ID NO:34は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子として知られ、公的なアクセッション番号BAA00881を有する。SEQ ID NO:35は、ヒトtoll-様受容体3として知られ、公的なアクセッション番号NP_003256を有する。SEQ ID NO:36は、ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（uPA）として知られ、公的なアクセッション番号CAA01390を有する。]
[0074] SEQID NO:37〜51は、モノマーリガンドペプチドの例を表す。SEQ ID NO:37〜51の各々は、図9において、親タンパク質の名称または省略名の次に、それが表す親タンパク質のアミノ酸範囲の次に、慣例X#Zによって示される任意のアミノ酸置換変異が続くように表され、式中Xは交換されるアミノ酸の一文字アミノ酸コードであり、#は親タンパク質内のアミノ酸残基の位置または数であり、およびZは、新しい置換するアミノ酸の一文字アミノ酸コードである。]
[0075] SEQID NO:37は、SEQ ID NO:31の部分配列であり、図9において「PAI1 354-368」として表される。]
[0076] SEQID NO:38は、SEQ ID NO:31の部分配列であり、図9において「PAI1 300-309」として表される。]
[0077] SEQID NO:39は、SEQ ID NO:31の部分配列であり、図9において「PAI1 343-353」として表される。]
[0078] SEQID NO:40は、SEQ ID NO:32の部分配列であり、図9において「ビトロネクチン20-63」として表される。]
[0079] SEQID NO:41は、F32L置換変異を含むSEQ ID NO:32の部分配列であり、図9において「ビトロネクチン20-63 F32L」として表される。]
[0080] SEQID NO:42は、T29A置換変異を含むSEQ ID NO:32の部分配列であり、図9において「ビトロネクチン20-63 T29A」として表される。]
[0081] SEQID NO:43は、E42A置換変異を含むSEQ ID NO:32の部分配列であり、図9において「ビトロネクチン20-63 E42a」として表される。]
[0082] SEQID NO:44は、L43A置換変異を含むSEQ ID NO:32の部分配列であり、図9において「ビトロネクチン20-63 L43A」として表される。]
[0083] SEQID NO:45は、S23F、T52E、D53L、A56Y、およびE57Y置換変異を含むSEQ ID NO:45の部分配列であり、図9において「ビトロネクチン20-63変異体」として表される。]
[0084] SEQID NO:46は、SEQ ID NO:33の部分配列であり、図9において「カリクレイン2(25-256)」として表される。]
[0085] SEQID NO:47は、SEQ ID NO:33の部分配列であり、図9においてhK2(25-44)として表される。]
[0086] SEQID NO:48は、SEQ ID NO:33の部分配列であり、図9において「カリクレイン2(47-256)」として表される。]
[0087] SEQID NO:49は、SEQ ID NO:34の部分配列であり、図9において「tPA(301-308)」として表される。]
[0088] SEQID NO:50は、V55A、N57Y、T59N、S79K、D81K、およびG83E置換変異を含むSEQ ID NO:35の部分配列であり、図9において「Toll様受容体3 29-121 (V55A, N57Y, T59N, S79K, D81K, G83E)」として表される。]
[0089] SEQID NO:51は、H224A、D275A、およびS376A置換変異を含むSEQ ID NO:36の部分配列であり、図9において「ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(179-415)H224A, D275A, S376A」として表される。]
[0090] SEQID NO:52は、天然のスペーサー断片を作製するために用いられる完全長のタンパク質の例を表す。SEQ ID NO:52は、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エキソグルカナーゼ-6A前駆体（エキソセロビオヒドロラーゼ6A）（1,4-β-セロビオヒドロラーゼ6A）（β-グルカンセロビオヒドロラーゼ6A）（アビセラーゼ2）として知られ、公的なアクセッション番号Q9C1S9を有する。]
[0091] SEQID NO:53は、天然のスペーサー断片の例を表す。SEQ ID NO:53は、SEQ ID NO:52の部分配列であり、図9において「16aaリンカー」として表される。]
[0092] SEQID NO:54〜56は、人工スペーサーの例を表す。]
[0093] SEQID NO:57〜76は、本発明において有用なクラス1局在化テザーポリペプチドの例を表す。個々のペプチド成分の構成を示す以下のクラス1局在化テザーの各々のダイアグラムを、図14A〜14Bに示す。]
[0094] SEQID NO:57のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-1としても知られる。]
[0095] SEQID NO:58のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-2としても知られる。]
[0096] SEQID NO:59のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-3としても知られる。]
[0097] SEQID NO:60のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-4としても知られる。]
[0098] SEQID NO:61のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-5としても知られる。]
[0099] SEQID NO:62のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-6としても知られる。]
[0100] SEQID NO:63のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-7としても知られる。]
[0101] SEQID NO:64のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-8としても知られる。]
[0102] SEQID NO:65のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-9としても知られる。]
[0103] SEQID NO:66のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-10としても知られる。]
[0104] SEQID NO:67のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-11としても知られる。]
[0105] SEQID NO:68のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-12としても知られる。]
[0106] SEQID NO:69のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-13としても知られる。]
[0107] SEQID NO:70のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-14としても知られる。]
[0108] SEQID NO:71のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-15としても知られる。]
[0109] SEQID NO:72のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-16としても知られる。]
[0110] SEQID NO:73のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-17としても知られる。]
[0111] SEQID NO:74のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-18としても知られる。]
[0112] SEQID NO:75のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-19としても知られる。]
[0113] SEQID NO:76のクラス1局在化テザーはまた、本明細書において91-20としても知られる。]
[0114] SEQID NO:77〜95は、クラス1局在化テザーを構築するために用いられるポリペプチド断片の例を表す。]
[0115] SEQID NO:96は、クラス1局在化テザーを構築するために内部積荷として用いられるエピトープタグの例を表し、図14A〜14Bにおいて「TAG」として表される。]
[0116] SEQID NO:97〜99は、クラス1局在化テザーを構築するために用いられるスペーサーの例を表す。]
[0117] SEQID NO:100〜111は、本発明において有用なクラス3局在化テザーポリペプチドの例を表す。その個々のペプチド成分の構築を示す以下のクラス3局在化テザーポリペプチドの各々のダイアグラムを図15に示す。]
[0118] SEQID NO:100のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-1としても知られる。]
[0119] SEQID NO:101のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-2としても知られる。]
[0120] SEQID NO:102のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-3としても知られる。]
[0121] SEQID NO:103のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-4としても知られる。]
[0122] SEQID NO:104のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-5としても知られる。]
[0123] SEQID NO:105のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-6としても知られる。]
[0124] SEQID NO:106のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-7としても知られる。]
[0125] SEQID NO:107のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-8としても知られる。]
[0126] SEQID NO:108のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-9としても知られる。]
[0127] SEQID NO:109のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-10としても知られる。]
[0128] SEQID NO:110のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-11としても知られる。]
[0129] SEQID NO:111のクラス3局在化テザーはまた、本明細書において93-12としても知られる。]
[0130] SEQID NO:112〜129は、クラス3局在化テザーを構築するために用いられるポリペプチド断片の例を表す。]
[0131] SEQID NO:130は、クラス3局在化テザーを構築するための内部積荷として用いられるエピトープタグの例を表し、図15において「TAG」または「TAG/IC」として表される。]
[0132] SEQID NO:131は、クラス3局在化テザーを構築するために用いられる合成TACE/ADAM17切断部位の例を表す。]
[0133] SEQID NO:132〜139は、本発明において有用な組織特異的プロモーター配列の例を表す。]
[0134] SEQID NO:132は、動脈平滑筋特異的プロモーターの例であり、本明細書において同様にMOD5306としても知られ、その構造を図10において模式図で描写する。]
[0135] SEQID NO:133は、合成血管平滑筋細胞特異的プロモーターの例であり、本明細書において同様にMOD5309としても知られ、その構造を図11Aにおいて模式図で描写する。]
[0136] SEQID NO:134は、合成血管平滑筋細胞特異的プロモーターの例であり、本明細書において同様にMOD5312としても知られ、その構造を図11Bにおいて模式図で描写する。]
[0137] SEQID NO:135は、合成血管平滑筋細胞特異的プロモーターの例であり、本明細書において同様にMOD5315としても知られ、その構造を図11Cにおいて模式図で描写する。]
[0138] SEQID NO:136は、内皮細胞特異的プロモーターの例であり、本明細書において同様にMOD4012-ESM1としても知られ、その構造を図12Aにおいて模式図で描写する。]
[0139] SEQID NO:137は、内皮細胞特異的プロモーターの例であり、本明細書において同様にMOD4399-FLT1としても知られ、その構造を図12Bにおいて模式図で描写する。]
[0140] SEQID NO:138は、合成内皮細胞特異的プロモーターの例であり、本明細書において同様にMOD4790としても知られ、その構造を図13Aにおいて模式図で描写する。]
[0141] SEQID NO:139は、合成内皮細胞特異的プロモーターの例であり、本明細書において同様にMOD4791としても知られ、その構造を図13Bにおいて模式図で描写する。]
[0142] 3文字アミノ酸コードおよび1文字アミノ酸コードは本明細書において、当技術分野において一般的に知られているように用いられる。]
図面の簡単な説明

[0143] 図1A〜1Fは、スペーサーを伴うまたは伴わないホモポリリガンドの例を示す。
図2A〜2Jは、スペーサーを伴うまたは伴わないヘテロポリリガンドの例を示す。
図3A〜3Hは、局在化シグナルに連結したリガンドおよびポリリガンドの例を示す。
図4A〜4Gは、エピトープまたはレポーターに連結したポリリガンドの例を示す。
図5A〜5Iは、局在化シグナルおよびエピトープまたはレポーターに連結したポリリガンドの例を示す。
図6A〜6Eは、エピトープ、レポーター、および／または局在化シグナルに任意で連結したリガンドまたはポリリガンドが含まれる遺伝子構築物の例を示す。
リガンド遺伝子構築物を含有するベクターの例を示す。
リガンド遺伝子構築物を含有するベクターの例を示す。
リガンド遺伝子構築物を含有するベクターの例を示す。
リガンド遺伝子構築物を含有するベクターの例を示す。
ポリリガンドのコンビナトリアル合成にとって有用な連続的クローニングプロセスの例を示す。
リガンド、ポリリガンド、およびそのPAI-1阻害機序の例を示す。
動脈平滑筋特異的プロモーターの例を示す。
合成血管平滑筋細胞特異的プロモーターの例を示す。
合成血管平滑筋細胞特異的プロモーターの例を示す。
合成血管平滑筋細胞特異的プロモーターの例を示す。
図12A〜12Bは、内皮細胞特異的プロモーターの例を示す。
図13A〜13Bは、合成内皮細胞特異的プロモーターの例を示す。
クラス1局在化テザーの例を示す。
クラス1局在化テザーの例を示す。
クラス3局在化テザーの例を示す。
PAI-1リガンドおよびポリリガンドの例示的な阻害機序を示す。
図17A〜17Hは、デグロンおよび／または局在化シグナルに連結したPAI-1の例を示す。
図18A〜18Iは、任意でデグロンおよび／または局在化シグナルに連結したULTRAVECTOR（UV）可能化PAI-1cDNAが含まれる遺伝子構築物の例を示す。
ULTRAVECTOR（UV）可能化PAI-1遺伝子構築物を含有するベクターの例を示す。
ULTRAVECTOR（UV）可能化PAI-1遺伝子構築物を含有するベクターの例を示す。
ULTRAVECTOR（UV）可能化PAI-1遺伝子構築物を含有するベクターの例を示す。
ULTRAVECTOR（UV）可能化PAI-1遺伝子構築物を含有するベクターの例を示す。
図20A〜20Jは、デグロンに連結したスペーサーを伴うまたは伴わないリガンドおよびホモポリリガンドの例を示す。
図21A〜21Hは、デグロンに連結したスペーサーを伴うまたは伴わないヘテロポリリガンドの例を示す。
図22A〜22Fは、デグロンおよび局在化シグナルに連結したリガンドおよびポリリガンドの例を示す。
図23A〜23Gは、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結したリガンドまたはポリリガンドが含まれる遺伝子構築物の例を示す。]
[0144] 発明の詳細な説明
明細書および特許請求の範囲において用いられる用語は、当技術分野において理解される通常の意味を有する。たとえば、ポリヌクレオチドは、核酸と互換的に用いられ、これには一本鎖または二本鎖DNA、RNA、およびそのポリマー類似体が含まれる。]
[0145] キメラという用語は、その天然の状態で連続していない断片を含むことを意味する。たとえば、キメラポリヌクレオチドは、その天然の状態で連続していない断片を含むポリヌクレオチドを意味する。]
[0146] ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質という用語は、互換的に用いられ、アミノ酸のポリマーを表す。]
[0147] 合成遺伝子（または遺伝子の一部）は、野生型ポリヌクレオチド配列とは異なる非天然遺伝子（または遺伝子の一部）である。合成遺伝子（または遺伝子の一部）は、天然において連続していない1つまたは複数の核酸配列（キメラ配列）を含有してもよく、ならびに／または置換、挿入、および欠失、ならびにその組み合わせを包含してもよい。]
[0148] 非ヒト生物は、非ヒト霊長類、哺乳動物、脊椎動物、無脊椎動物、植物、ならびに酵母および粘菌が含まれる下等真核生物を包含する。]
[0149] 制限エンドヌクレアーゼは、核酸分子内の認識配列で核酸を切断する酵素である。]
[0150] 宿主細胞には、ATCC（Manassas, VA）から入手可能な細胞株、初代細胞培養、幹細胞、免疫細胞、血球、任意の臓器または組織からの細胞などの、市販のおよび非市販の細胞株が含まれるがこれらに限定されるわけではない。]
[0151] ベクターは、核酸のクローニングおよび／または宿主細胞への移入のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、もう1つのDNAセグメントが、付着したセグメントの複製をもたらすように付着してもよいレプリコンであってもよい。レプリコンは、インビボでDNA複製の自律単位として機能する、すなわち自身の制御下で複製することができる任意の遺伝エレメント（たとえば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。ベクターという用語には、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルスビヒクルの双方が含まれる。当技術分野において公知の多数のベクターを用いて、核酸を操作してもよく、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み入れてもよい等である。ありうるベクターには、たとえば、λ誘導体などのバクテリオファージ、pBR322もしくはpUCプラスミド誘導体などのプラスミド、またはBluescriptベクターが含まれる、プラスミドもしくは改変ウイルスが含まれる。本発明において有用であるベクターのもう1つの例は、参照により本明細書に組み入れられるWO2007/038276において記述されるUltraVector（商標）産生システム（Intrexon Corp., Blacksburg, VA）である。たとえば、応答エレメントに対応するDNA断片およびプロモーターを適したベクターに挿入することは、相補的な付着末端を有する選ばれたベクターに適切なDNA断片をライゲーションすることによって成就されうる。または、DNA分子の端部を酵素的に改変してもよく、またはヌクレオチド配列（リンカー）をDNA末端にライゲーションすることによって任意の部位を生成してもよい。そのようなベクターは、マーカーを細胞ゲノムに組み入れた細胞の選択を提供する選択可能なマーカー遺伝子を含有するように工学操作されてもよい。そのようなマーカーはまた、マーカーによってコードされたタンパク質を組み入れて発現する宿主細胞の同定および／または選択を許容する。]
[0152] ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞のみならず生きている動物被験体における広く多様な遺伝子送達適用において用いられている。用いることができるウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、およびカリモウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、DNA-タンパク質複合体、およびバイオポリマーが含まれる。核酸のほかに、ベクターはまた、1つまたは複数の調節領域および／または核酸移入結果（組織への移入、発現期間等）を選択、測定、およびモニターするために有用な選択可能なマーカーを含んでもよい。]
[0153] プラスミドという用語は、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子をしばしば運び、通常、環状の二本鎖DNA分子の形状である染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、その中で多数のヌクレオチド配列が、適切な3'非翻訳配列と共に、プロモーター断片と選択された遺伝子産物に関するDNA配列とを細胞に導入することができる独自の構造に連結されているまたは組み換えられている、任意の起源に由来する、自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAの直線型、環状型、またはスーパーコイル型であってもよい。]
[0154] クローニングベクターは、付着したセグメントの複製を生じるようにそれに対してもう1つの核酸セグメントが付着してもよい、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどの、連続的に複製しかつ複製開始点を含む単位長の核酸、好ましくはDNAであるレプリコンを指す。クローニングベクターは、1つの細胞タイプにおいて複製を、およびもう1つの細胞タイプにおいて発現を行うことができてもよい（シャトルベクター）。クローニングベクターは、ベクターを含む細胞を選択するために用いることができる1つまたは複数の配列および／または関心対象配列を挿入するための1つまたは複数のマルチクローニング部位を含んでもよい。]
[0155] 発現ベクターという用語は、宿主において形質転換後に挿入された核酸配列を発現させることができるように設計されたベクター、プラスミド、またはビヒクルを指す。クローニングされた遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー等の制御エレメントの制御下に置かれる。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動するために有用である開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、病因または疾患関連プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導型プロモーター、光調節プロモーター；CYC1、HIS3、GALl、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、アルカリホスファターゼプロモーター（サッカロミセス（Saccharomyces）における発現にとって有用）；AOX1プロモーター（ピチア（Pichia）における発現にとって有用）；β-ラクタマーゼ、lac、ara、tet、trp、1PL、1PR、T7、tac、およびtrcプロモーター（大腸菌（Escherichia coli）における発現にとって有用）；光調節、種子特異的、花粉特異的、子房特異的、カリフラワーモザイクウイルス35S、CMV 35S最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（CsVMV）、葉緑体a/b結合タンパク質、リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導型、コメツングロバシリフォームウイルス、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸塩レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現にとって有用）；SV40初期（SV40e）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の3'長末端反復（LTR）に含有されるプロモーター、アデノウイルス（Ad）のE1Aまたは主要後期プロモーター（MLP）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、バキュロウイルスIE1プロモーター、伸長因子1α（EF1）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）プロモーター、ユビキチン（Ubc）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン-Lプロモーターの調節配列および転写制御領域、遍在性プロモーター（HPRT、ビメンチン、β-アクチン、チューブリン等）、中間フィラメントのプロモーター（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP等）、治療遺伝子のプロモーター（MDR、CFTR、または第VIII因子型等の）、病因または疾患関連プロモーター、ならびに膵腺房細胞において活性であるエラスターゼI遺伝子制御領域などの、組織特異性を示してトランスジェニック動物において利用されているプロモーター、が含まれるがこれらに限定されるわけではない当技術分野において公知の動物および哺乳動物プロモーター；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳腺、リンパ系、および肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域；アルブミン遺伝子、肝臓において活性なApoAIおよびApo AII制御領域、肝臓において活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性なα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞において活性なβ-グロビン遺伝子制御領域、脳の乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質制御領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸管タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞β-アクチンプロモーター等が含まれるがこれらに限定されるわけではない、これらの遺伝子の発現を駆動することができる実質的にいかなるプロモーターも、発現ベクターにおいて用いることができる。加えて、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列等を付加することによって改変されてもよい。]
[0156] ベクターは、当技術分野において公知の方法、たとえばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（ライソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体によって所望の宿主細胞に導入されてもよい（たとえば、Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963 (1992)；Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621 (1988)；およびHartmut et al.,カナダ国特許出願第2,012,311号を参照されたい）。]
[0157] 本発明に従うポリヌクレオチドはまた、リポフェクションによってインビボで導入されうる。過去10年のあいだに、インビトロでの核酸の封入およびトランスフェクションのためにリポソームがますます用いられている。リポソーム媒介トランスフェクションの際に遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成陽イオン脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413 (1987)；Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)；およびUlmer et al., Science 259:1745 (1993)）。陽イオン脂質を用いることは、陰性荷電核酸の封入を促進して、同様に陰性荷電細胞膜との融合を促進する可能性がある（Felgner et al., Science 337:387 (1989)）。核酸の移入にとって特に有用な脂質化合物および組成物は、WO95/18863、WO96/17823、およびU.S. 5,459,127において記述される。インビボで特異的臓器に外因性の遺伝子を導入するためにリポフェクションを用いることは、一定の実際的な長所を有する。特異的細胞へのリポソームの分子標的化は、1つの恩恵領域である。特定の細胞タイプにトランスフェクションを向けることは、膵臓、肝臓、腎臓、および脳などの細胞不均一性を有する組織において特に好ましいであろうことは明白である。脂質を、標的化のために他の分子に化学的にカップリングしてもよい（Mackey et al. 1988、前記）。標的化されたペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子を、リポソームに化学的にカップリングさせることができるであろう。]
[0158] 陽イオンオリゴペプチド（たとえば、WO95/21931）、DNA結合タンパク質に由来するペプチド（たとえば、WO96/25508）、または陽イオンポリマー（たとえば、WO95/21931）などの他の分子も同様に、インビボで核酸のトランスフェクションを容易にするために有用である。]
[0159] ベクターをインビボで裸のDNAプラスミド（米国特許第5,693,622号、第5,589,466号および第5,580,859号）として導入することも可能である。受容体媒介DNA送達アプローチも同様に用いることができる（Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147 (1992)；およびWu et al., J. Biol. Chem. 262:4429 (1987)）。]
[0160] トランスフェクションという用語は、外因性または異種のRNAまたはDNAの細胞による取り込みを指す。細胞は、そのようなRNAまたはDNAが細胞内部に導入されている場合に、外因性または異種RNAまたはDNAによってトランスフェクトされている。細胞は、トランスフェクトされたRNAまたはDNAが表現型の変化を行う場合に、外因性または異種RNAまたはDNAによって形質転換されている。形質転換するRNAまたはDNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み入れられうる（共有結合的に連結されうる）。]
[0161] 形質転換は、それによって遺伝学的に安定な遺伝が得られる、宿主生物のゲノムへの核酸断片の移入を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、トランスジェニック、組み換え型、または形質転換生物と呼ばれる。]
[0162] 加えて、本発明に従うポリヌクレオチドを含む組み換え型ベクターには、その増幅またはその発現が求められる細胞宿主において1つもしくは複数の複製開始点、マーカー、または選択可能なマーカーが含まれてもよい。]
[0163] 選択可能なマーカーという用語は、関心対象核酸の遺伝を追跡するためにおよび／または関心対象核酸を遺伝した細胞または生物を同定するためにその効果が用いられる、マーカー遺伝子の効果に基づいて選択されうる同定因子、通常、抗生物質または化学物質耐性遺伝子、すなわち抗生物質に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色定量マーカー、酵素、蛍光マーカー等を指す。当技術分野において公知であり、用いられる選択可能なマーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミド等に対する耐性を提供する遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわちアントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等が含まれる。]
[0164] レポーター遺伝子という用語は、関心対象核酸の遺伝を追跡するために、関心対象核酸を遺伝した細胞または生物を同定するために、および／または遺伝子発現の誘導または転写を測定するためにその効果が用いられる、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定されうる同定因子をコードする核酸を指す。当技術分野において公知であり用いられるレポーター遺伝子の例には：ルシフェラーゼ（Luc）、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、β-グルクロニダーゼ（Gus）等が含まれる。選択可能なマーカー遺伝子はまた、レポーター遺伝子であると見なされてもよい。]
[0165] プロモーターおよびプロモーター配列は互換的に用いられ、コード配列または機能的RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。一般的に、コード配列はプロモーター配列の3'に位置する。プロモーターは、その全体が本来の遺伝子に由来してもよく、天然において見いだされる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてもよく、または合成DNAセグメントをも含んでよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞タイプにおいて、異なる発生段階で、または異なる環境もしくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示する可能性があることは、当業者によって理解される。ほとんどの細胞タイプにおいてほとんどの時間に遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、構成的プロモーターと呼ばれる。特異的細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターと呼ばれる。特異的発生段階または細胞分化段階で遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、発生特異的プロモーターまたは細胞分化特異的プロモーターと呼ばれる。プロモーターを誘導する物質、生体分子、化学物質、リガンド、光等によって細胞を曝露または処置した後に誘導されて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に誘導型プロモーターまたは調節可能プロモーターと呼ばれる。さらに、ほとんどの場合において、調節配列の正確な境界は完全に定義されていないことから、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有する可能性があると認識される。]
[0166] プロモーター配列は典型的に、転写開始部位によってその3'末端で境界を定められ、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最少数の塩基またはエレメントが含まれるように上流（5'方向）に伸びる。プロモーター配列において、転写開始部位（便宜上たとえばヌクレアーゼS1によるマッピングによって定義される）のみならず、RNAポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされるであろう。]
[0167] 相同性という用語は、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド部分のあいだの同一性の百分率を指す。1つの部分からもう1つの部分までの配列間の対応は、当技術分野において公知の技術によって決定されうる。たとえば、相同性は、配列情報をアラインメントして、容易に入手可能なコンピュータープログラムを用いることによって、2つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定されうる。または、相同性は、相同な領域のあいだで安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化された断片のサイズ決定によって決定されうる。]
[0168] 本明細書において用いられるように、その全ての文法的な形および綴りの変化での相同なという用語は、スーパーファミリー（たとえば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタンパク質が含まれる共通の進化起源を保有するタンパク質と、異なる種からの相同なタンパク質（たとえば、ミオシン軽鎖等）とのあいだの関係を指す（Reeck et al., Cell 50:667 (1987)）。そのようなタンパク質（およびそのコードする遺伝子）は、その高い程度の配列類似性によって反映されるように配列相同性を有する。しかし、一般的な使用および本出願において、高度になどの副詞によって修飾された場合の相同なという用語は、共通の進化起源ではなくて配列類似性を指すことがある。]
[0169] したがって、その全ての文法的な形での配列類似性という用語は、共通の進化起源を共有してもよくしなくてもよい核酸またはタンパク質のアミノ酸配列のあいだの同一性または対応の程度を指す（Reeck et al., Cell 50:667 (1987)を参照されたい）。1つの態様において、2つのDNA配列は、ヌクレオチドの少なくとも約50％（たとえば、少なくとも約75％、90％、または95％）がDNA配列の定義された長さに対してマッチングする場合に実質的に相同または実質的に類似である。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを用いて、または特定のシステムに関して定義されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において配列を比較することによって同定されうる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは当技術分野の技術の範囲内である（たとえば、Sambrook et al., 1989、前記を参照されたい）。]
[0170] 本明細書において用いられるように、実質的に類似とは、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化によって1つまたは複数のアミノ酸の置換が起こるが、DNA配列によってコードされるタンパク質の機能的特性には影響を及ぼさない核酸断片を指す。実質的に類似とはまた、1つまたは複数のヌクレオチド塩基に変化が起こっても、アンチセンスまたは共抑制技術によって核酸断片が遺伝子発現の変更を媒介する能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。実質的に類似とはまた、得られた転写物の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない1つまたは複数のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などの本発明の核酸断片の改変を指す。ゆえに、本発明は、特異的な例示的配列より多くを包含すると理解される。提唱される改変の各々は、コードされる産物の生物活性の保持の決定と同様に、当技術分野の技術のルーチンの範囲内である。]
[0171] その上、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似の配列が同様に、ストリンジェントな条件下（0.1×SSC、0.1％SDS、65℃の後に2×SSC、0.1％SDSでの洗浄の後に0.1×SSC、0.1％SDS）で、本明細書において例示される配列とのそのハイブリダイズ能によって定義されることを認識する。本発明の実質的に類似の核酸断片は、そのDNA配列が、本明細書において報告した核酸断片のDNA配列と少なくとも約70％、80％、90％、または95％同一である核酸断片である。]
[0172] 対応するという用語は、本明細書において、正確な位置が、それに対して類似性または相同性が測定される分子と同一であるかまたは異なるかによらず、類似または相同な配列を指すために用いられる。核酸またはアミノ酸配列アラインメントには空白が含まれてもよい。このように、対応するという用語は、配列類似性を指し、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを指すのではない。]
[0173] アミノ酸またはヌクレオチド配列の実質的な部分は、当業者による配列の手動での評価によって、またはBLAST（Basic Local Alignment Search Tool；Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1993)；ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手可能）などのアルゴリズムを用いるコンピューター自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するために十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般的に、ポリペプチドまたは核酸配列を公知のタンパク質または遺伝子と相同であると推定的に同定するためには、10個もしくはそれより多い連続するアミノ酸の配列、または30個もしくはそれより多いヌクレオチドの配列が必要である。その上、ヌクレオチド配列に関して、連続するヌクレオチド20個〜30個を含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、配列依存的遺伝子同定（たとえば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（たとえば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）法において用いてもよい。加えて、12〜15塩基の短いオリゴヌクレオチドを、プライマーを含む特定の核酸断片を得るためにPCRにおける増幅プライマーとして用いてもよい。したがって、ヌクレオチド配列の実質的な部分は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。]
[0174] 本発明の1つの局面は、デグロンに連結されたPAI-1タンパク質を提供することである。デグロンは、PAI-1タンパク質のアミノ末端またはそのカルボキシ末端に連結されてもよい。デグロンまたは分解決定シグナルは、当技術分野において、短い、しばしばポリペプチドの分解を誘導する移動型のエレメントとして知られており、そのいくつかの例は、Garcin, D, et al., Journal of Virology, 2004, 78(16):8799-8811およびGardner, RG and Hampton, RY, TheEMBO Journal, 1999, 18(21):5994-6004において引用されている。デグロンに連結したPAI-1の例を図17A、17B、17E、I7F、17G、および17Hに示す。]
[0175] 本発明のもう1つの局面は、局在化シグナルに連結したPAI-1タンパク質を提供することである。細胞局在化シグナルの非制限的な例は、筋小胞体、小胞体、細胞外マトリクス、ミトコンドリア、ゴルジ体、ペルオキシソーム、ライソソーム、核、核小体、エンドソーム、エキソソーム、他の細胞内小胞、形質膜、頂端膜、および側底膜に局在するシグナルである。1つの態様において、PAI-1は、米国特許仮出願第60/957,328号において記述されるものなどの非細胞特異的形質膜局在化シグナルを通して細胞外面に送達される。他の態様において、PAI-1は、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、および心筋細胞の筋細胞膜に特異的な局在化シグナルなどの細胞特異的局在化シグナルについて細胞外の面に送達される。他の態様において、PAI-1は、コラーゲン結合タンパク質などの細胞外会合ドメインを通して細胞外マトリクスに、または心筋梗塞領域において濃縮される他の細胞外成分に送達される。図17C〜17Hは、局在化シグナルに連結したPAI-1の追加の態様を示す。該局在化シグナルは、制限することなく例として与えられる。]
[0176] 本発明の1つの局面は、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を提供することである。1つの態様において、ポリヌクレオチドは、ULTRAVECTOR（Intrexon Corp. Blacksburg, VA, US2004/0185556）プラスミドベクターに挿入するために最適化される。もう1つの態様において、ポリヌクレオチドは、以下の内部制限部位の除去を通してベクター挿入に関して最適化される：NgoM IV、Xma I、Cla I、BamH I、BstB I、EcoR I、RcoR V、Pci I、Sac I、Stu I、ApaL I、Bgl II、Kpn I、Mfe I、Nde I、Nhe I、Nsi I、Asc I、AsiS I、BsiW I、Fse I、Mlu I、Not I、Pac I、Sal I、Sbf I、SnaB I、Swa I、Rsr III、RsrII2、BstX I、Sap I、BsmB I、Xba I、Xho I、Hpa I、Pml I、Sph I、Aar I、Bgl I、BsmB I、BspM I、BstAPI、BstX I、Dra III、Ear I、Sap I、Blp I、およびBspE I。]
[0177] 本発明の1つの局面は、デグロンポリヌクレオチド配列に連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を提供することである。1つの態様において、デグロン配列は、PAI-1ポリヌクレオチド配列の5'端に連結される（たとえば、図18Cおよび18Hを参照されたい）。本発明のもう1つの態様において、デグロン配列は、デグロンポリヌクレオチド配列の3'端に連結される（たとえば、図18Bおよび18Fを参照されたい）。]
[0178] 本発明のもう1つの局面は、局在化シグナルに連結した、ベクター挿入に関して最適化されているPAI-1ポリヌクレオチド配列を提供することである（たとえば、図18D〜18Iを参照されたい）。]
[0179] 本発明のもう1つの態様は、所望の細胞、組織、または生理的状態におけるベクター挿入最適化PAI-1ポリヌクレオチド配列の発現を選択的に制御するための遺伝子構築物に関する。遺伝子構築物には、デグロンおよび／または局在化シグナルに任意で連結されたPAI-1遺伝子構築物が含まれてもよい。例示的な遺伝子構築物は、図13A〜13E、23A〜23G、および18A〜18Iにおいて示される。遺伝子構築物のプロモーター部分は、構成的プロモーター、非構成的プロモーター、組織特異的プロモーター（構成的または非構成的）、または誘導型プロモーターでありうる。本発明にとって有用な組織特異的プロモーターの非制限的な例は、内皮細胞特異的プロモーター（White, SJ, et al., Gene Ther. 2007 Nov 8 [印刷前電子出版]）、血管平滑筋細胞特異的プロモーター（Ribault, S,Circ Res., 2001, 88(5):468-75；Appleby, CE, et al., Gene Ther. 2003, 10(18): 1616-22）、心筋細胞特異的プロモーター（Xu, L, et al., J Biol Chem., 2006, 281(45):34430-40）、冠動脈脂肪細胞特異的プロモーター、および心線維芽細胞特異的プロモーターである。心臓および低酸素症特異的プロモーターなどの複合的な組織および状態特異的プロモーター（Su, H, et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2004, 101(46): 16280-5）も同様に本発明にとって有用である。誘導型プロモーターは、薬物または他の因子によって活性化される。RHEOSWITCHは、本発明にとって有用であるNew England BioLabs（Ipswich, MA）から入手可能な誘導型プロモーターシステムである。本発明の態様は、その発現が誘導型プロモーターシステムによって制御されるPAI-1遺伝子構築物を含む。]
[0180] 本発明のもう1つの局面は、本明細書において記述される哺乳動物細胞発現およびベクター挿入最適化PAI-1ポリヌクレオチド配列を発現させるための遺伝子構築物を含有するベクターを提供することである。ベクターは、本明細書において記述されるウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。そのようなベクターの非制限的な例を図19A〜19Dに示す。]
[0181] 図19Aは、ベクター挿入最適化PAI-1ポリヌクレオチド配列および任意の局在化シグナルおよび／またはデグロンを含有するベクターの一般型を示し、遺伝子構築物はトランスジェニック動物を生成するために有用な単位としてベクターから放出可能である。たとえば、遺伝子構築物またはトランスジーンは、制限エンドヌクレアーゼ消化によってベクター骨格から放出される。放出されたトランスジーンをマウス受精卵の前核に注入するか、またはトランスジーンは胚幹細胞を形質転換するために用いられる。図19Aのベクターはまた、プロモーターおよびトランスジーンのコドンが哺乳動物発現にとって最適化される、トランスジーンの一過性のトランスフェクションにとっても有用である。]
[0182] 図19Bおよび19Cは、インビボでPAI-1ポリペプチド発現を送達および制御するための遺伝子治療ベクターの態様を描写する。図19Bおよび19Cにおける遺伝子構築物に連結されたポリヌクレオチド配列には、ウイルスゲノムおよび／または宿主ゲノムへのトランスジーンの組み込みを容易にするためのゲノム組み込みドメインが含まれる。]
[0183] 図19Dは、安定な細胞株を生成するために有用な局在化シグナル遺伝子構築物を含有するベクターを示す。]
[0184] 本発明のもう1つの局面は、本明細書において記述される哺乳動物細胞発現およびベクター挿入最適化PAI-1ポリヌクレオチド配列を発現させるための遺伝子構築物を含有するベクターを含有する宿主細胞を提供することである。1つの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、およびモルモットが含まれる。宿主細胞の特異的タイプには、心筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および脂肪細胞が含まれる。]
[0185] 本発明のもう1つの局面は、哺乳動物細胞発現およびベクター挿入最適化PAI-1ポリヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック生物を提供することである。1つの態様において、トランスジェニック宿主は哺乳動物である。哺乳動物トランスジェニック宿主には、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、およびモルモットが含まれる。トランスジェニック生物は、受精卵の前核または胚幹細胞に完全なトランスジーンを注入することによって生成される。完全なトランスジーンには、任意で、本明細書において記述されるデグロン、局在化シグナル、または構成的プロモーター、非構成的プロモーター、組織特異的プロモーター（構成的または非構成的）、もしくは誘導型プロモーターに連結された哺乳動物細胞発現およびベクター挿入最適化PAI-1ポリヌクレオチド配列が含まれる。トランスジェニック生物は、心臓におけるPAI-1の役割を定義するための動物モデルとして用いられてもよい。]
[0186] 本発明のもう1つの局面は、PAI-1の少なくとも1コピーをコードするベクター挿入最適化核酸分子を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトする段階、およびトランスフェクトした宿主細胞をPAI-1の少なくとも1コピーを産生するために適した条件下で培養する段階を含む、宿主細胞においてPAI-1の発現を変更させる方法である。]
[0187] 本発明のもう1つの局面は、PAI-1の少なくとも1コピーをコードするベクター挿入最適化核酸分子を含むベクターを被験体の心組織に注入する段階を含む、被験体の心組織においてPAI-1の発現を変更させる方法である。]
[0188] 本発明のもう1つの局面は、PAI-1の少なくとも1コピーをコードするベクター挿入最適化核酸分子を含むベクターを受精卵または胚幹細胞に注入する段階を含む、変更されたPAI-1発現を有するトランスジェニック被験体を作製する方法である。]
[0189] 本発明の1つの局面は、切断および／またはアミノ酸置換によって天然の基質および／または調節物質を改変することによってPAI-1活性の新規リガンド阻害因子を提供することである。]
[0190] 本発明のもう1つの局面は、新規阻害因子およびその変種を共に連結させることによってPAI-1活性のモジュール性のポリリガンド阻害因子を提供することである。本発明のさらなる局面は、デグロンに連結させることによってPAI-1阻害因子、リガンド、またはポリリガンドの活性を制限することである。本発明のさらなる局面は、局在化シグナルに連結することによるPAI-1阻害因子、リガンド、またはポリリガンドの細胞局在である。]
[0191] 本発明の1つの局面は、心組織における線維症を予防するための方法としてPAI-1の阻害を包含する。PAI-1を阻害することによって、プラスミノーゲン活性化因子の阻害が軽減され、それによってプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化およびフィブリンの分解が起こる。疾患を有する心臓のフィブリン分解の増強は、II型糖尿病、高血糖症、高血圧症、肥満、タバコの曝露、または他の原因による心筋症を処置または予防するための有望なアプローチである。]
[0192] 本発明の追加の局面は、任意の組織において有用なPAI-1阻害因子を包含する。]
[0193] 本発明の追加の態様は、細胞の1つの領域に標的化された局在化シグナルに連結することによって異なる細胞位置に局在したPAI-1阻害因子を包含する。]
[0194] 本発明は、PAI-1のポリペプチドリガンドおよびポリリガンドに関する。PAI-1リガンドおよびポリリガンドの様々な態様をSEQID NO:1〜30およびSEQ ID NO:37〜51に表す。より具体的に、本発明は、SEQ ID NO:37〜51の任意の1つまたはそれより多くを含むリガンド、ホモポリリガンド、およびへテロポリリガンドに関する。加えて、本発明は、SEQ ID NO:31〜36の1つまたは複数の部分配列（切断断片）またはその任意の部分を含むリガンドおよびポリリガンドに関する。さらに、本発明は、SEQ ID NO:37〜51の1つもしくは複数またはその任意の部分を含むポリリガンドに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、および99％配列同一性を有するポリリガンドに関する。さらに、本発明は、SEQ ID NO:31〜36の1つまたは複数の部分配列を含むポリリガンドに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、および99％配列同一性を有するポリリガンドに関する。]
[0195] ホモポリリガンドまたはヘテロポリリガンドであり得るポリリガンドは、2つまたはそれより多いモノマーポリペプチドリガンドで構成されるキメラリガンドである。ホモポリリガンドの例を図4A〜4Fに示す。ヘテロポリリガンドの例を図6A〜6Jに示す。モノマーリガンドの例は、SEQID NO:40によって表されるポリペプチドである。SEQ ID NO:40は、親の完全長のSEQ ID NO:32の選択された部分配列である。ホモポリリガンドの例は、SEQ ID NO:37のダイマーまたはマルチマーを含むポリペプチドである。ヘテロポリリガンドの例は、SEQ ID NO:37およびSEQ ID NO:38〜51の1つまたは複数を含むポリペプチドである。SEQ ID NO:37〜51の各々は、モノマー型の個々のポリペプチドリガンドを表す。SEQ ID NO:37〜51は、SEQ ID NO:31〜36の部分配列の選択された例であるが、SEQ ID NO:31〜36の他の部分配列も同様にモノマーリガンドとして利用されてもよい。SEQ ID NO:31〜36のモノマー部分配列は、SEQ ID NO:40などの親ポリペプチドの部分と同一であってもよい。加えて、SEQ ID NO:31〜36のモノマー部分配列は、SEQ ID NO:41〜45などのアミノ酸置換を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、SEQ ID NO:37〜51の1つまたは複数におけるアミノ酸配列を含むリガンドに対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、および99％配列同一性を有してもよい。さらに、モノマーリガンドおよびポリリガンドは、SEQ ID NO:31〜36の部分配列に対して少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、および99％配列同一性を有してもよい。]
[0196] SEQID NO:37〜51をホモポリマーまたはヘテロポリマーリガンドに組み合わせるために多数の方法がある。さらに、ポリマーリガンドを作出するために、SEQ ID NO:31〜36の追加の部分配列を互いに、およびSEQ ID NO:37〜51と組み合わせるためには多数の方法がある。ホモポリリガンド構成の非制限的な例を図1A〜1Fに示す。ヘテロポリリガンド構成の非制限的な例を2A〜2Jに示す。本発明は、ホモポリリガンドおよびへテロポリリガンドの起こりうる全ての組み合わせに向けられるがこれらに限定されない。本発明のリガンドおよびポリリガンドは、PAI-1の内因性の効果をモジュレートするように設計される。]
[0197] 本発明の1つの態様において、リガンドまたはポリリガンドは、本明細書において記述されるPAI-1リガンドまたはポリリガンドである。]
[0198] 本発明のもう1つの態様において、リガンドまたはポリリガンドは、本明細書において記述されるPAI-1リガンドまたはポリリガンドに対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である。]
[0199] 本発明のもう1つの態様において、リガンドまたはポリリガンドは、1つまたは複数のアミノ酸欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含むように改変されている本明細書において記述されるPAI-1リガンドまたはポリリガンドである。]
[0200] 本発明のもう1つの態様は、SEQID NO:1〜30の奇数番号のSEQ ID NOにおいて示されるポリペプチドに対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるポリペプチドである。]
[0201] 本発明のもう1つの態様は、SEQID NO:1〜30の偶数番号のSEQ ID NOにおいて示されるポリヌクレオチドに対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるポリヌクレオチドである。]
[0202] 本発明のもう1つの態様において、PAI-1リガンドまたはポリリガンドは、SEQID NO:37〜51の1つに対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である少なくとも1つのペプチドを含む。]
[0203] 本発明のもう1つの態様において、PAI-1リガンドまたはポリリガンドは、以下の阻害機序の少なくとも1つを保有する：潜在状態、PA1の基質への変化、tPA結合に対する立体障害、内因性のビトロネクチンに対する立体障害、または結合部位に対する直接競合。]
[0204] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるPAI-1リガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドである。]
[0205] 本発明のポリリガンドは任意で、モノマーの前、後、またはあいだにスペーサーアミノ酸を含む（例示的な構成に関しては図1D〜1Fおよび図2F〜2Jを参照されたい）。]
[0206] 本発明は、上記または下記で与えられる例に限定されないホモポリリガンドとヘテロポリリガンドの全ての組み合わせを捕らえることを意図する。本明細書の記述において、「リガンド」という用語の使用は、モノマーリガンド、ポリマーリガンド、ホモポリマーリガンドおよび／またはヘテロポリマーリガンドを包含する。リガンドという用語はまた、デコイ、阻害因子、およびモジュレータという用語を包含する。]
[0207] モノマーリガンドは、ポリペプチドの少なくとも一部がPAI-1によって認識されることができるポリペプチドである。認識することができるポリペプチドの部分は、認識モチーフと名付けられる。本発明において、認識モチーフは天然または合成でありうる。認識モチーフの例は当技術分野において周知であり、これには天然に存在するPAI-1基質、偽基質モチーフ、およびPAI-1調節結合タンパク質に存在する相互作用ドメインおよびその改変物が含まれるがこれらに限定されるわけではない。]
[0208] 一般的に、天然のPAI-1相互作用パートナーに基づくリガンドモノマーは、推定のPAI-1相互作用ドメイン認識モチーフを同定および単離することによって構築される。例示的な天然のPAI-1相互作用パートナーは、当技術分野において公知であり、これには、フィブリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（SEQID NO:34によって表されるタンパク質）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（SEQ ID NO:36によって表されるタンパク質）、およびビトロネクチン（SEQ ID NO:32によって表されるタンパク質）が含まれる。追加のモノマーには、PAI-1認識モチーフのみならず、PAI-1相互作用ドメイン認識モチーフのいずれかの側面で近接および連続するアミノ酸が含まれる。ゆえに、モノマーリガンドは、モノマーにPAI-1認識モチーフが含まれる限り、任意の長さであってもよい。たとえば、モノマーはPAI-1認識モチーフを含んでもよく、認識モチーフに近接して少なくとも 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、もしくは100個、またはそれより多くのアミノ酸を含んでもよい。さらに、設計の検討は、リガンドの三次元モデリングおよびPAI-1との結合相互作用のモデリングから得られる。リガンドまたはポリリガンドの一次配列の改変は、そのようなモデリングに基づくのが望ましい可能性がある。]
[0209] たとえば、1つの態様において、本発明は、以下からなる群より選択されるペプチドの少なくとも1コピーを含むPAI-1の阻害因子を含む：
a）SEQID NO:31のアミノ酸残基354〜368位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；
b）SEQ ID NO:31のアミノ酸残基300〜309位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；
c）SEQ ID NO:31のアミノ酸残基343〜353位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；
d）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；
e）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基32位に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンからロイシンに変異しているペプチド；
f）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基29位に対応するアミノ酸残基がトレオニンからアラニンに変異しているペプチド；
g）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基42位に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸からアラニンに変異しているペプチド；
h）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基43位に対応するアミノ酸残基がロイシンからアラニンに変異しているペプチド；
i）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基23位に対応するアミノ酸残基がセリンからフェニルアラニンに変異しており、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基52位に対応するアミノ酸残基がトレオニンからグルタミン酸に変異しており、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基53位に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸からロイシンに変異しており、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基56位に対応するアミノ酸残基がアラニンからチロシンに変異しており、およびSEQ ID NO:32のアミノ酸残基57位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン酸からチロシンに変異しているペプチド；
j）SEQ ID NO:33のアミノ酸残基25〜256位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；
k）SEQ ID NO:33のアミノ酸残基25〜44位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；
l）SEQ ID NO:33のアミノ酸残基47〜256位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；
m）SEQ ID NO:34のアミノ酸残基301〜308位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；
n）SEQ ID NO:35のアミノ酸残基29〜121位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基55位に対応するアミノ酸残基がバリンからアラニンに変異しており、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基57位に対応するアミノ酸残基がアスパラギンからチロシンに変異しており、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基59位に対応するアミノ酸残基がトレオニンからアスパラギンに変異しており、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基79位に対応するアミノ酸残基がセリンからリジンに変異しており、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基81位に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸からリジンに変異しており、およびSEQ ID NO:35のアミノ酸残基83位に対応するアミノ酸残基がグリシンからグルタミン酸に変異しているペプチド；ならびに
o）SEQ ID NO:36のアミノ酸残基179〜415位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:36のアミノ酸残基224位に対応するアミノ酸残基がヒスチジンからアラニンに変異しており、SEQ ID NO:36のアミノ酸残基275位に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸からアラニンに変異しており、およびSEQ ID NO:36のアミノ酸残基376位に対応するアミノ酸残基がセリンからアラニンに変異しているペプチド。]
[0210] 本明細書において用いられるように、配列アラインメントに関する場合の「対応する」および「対応している」という用語は、参照タンパク質（たとえば、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子1、AAA60009、SEQID NO:31）内での順序位置と、参照タンパク質上の位置とアラインメントするそれらの位置を意味すると意図される。このように、対象ペプチドのアミノ酸配列を参照ペプチドのアミノ酸配列、たとえばSEQ ID NO:31とアラインメントさせると、参照ペプチド配列のある順序位置に「対応する」対象ペプチド配列におけるアミノ酸は、参照ペプチド配列のこれらの位置とアラインメントするが、参照配列のこれらの正確な位置番号に必ずしもないアミノ酸である。配列間で対応するアミノ酸を決定するために配列をアラインメントさせるための方法を、以下に記述する。]
[0211] 他の態様において、リガンドはモノクローナル抗体断片、ファージディスプレイ産物、PAI-1合成阻害因子、または転写因子デコイであってもよい。]
[0212] モノマーリガンドはポリペプチドの少なくとも一部がPAI-1によって認識されることができるポリペプチドである。認識されることができるポリペプチドの部分は、認識モチーフと名付けられる。本発明において、認識モチーフは天然または合成でありうる。認識モチーフの例は当技術分野において周知であり、これには天然に存在するPAI-1基質、偽基質モチーフ、ならびにPAI-1調節結合タンパク質に存在する相互作用ドメイン、およびその改変体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。]
[0213] ポリマーリガンド（ポリリガンド）は2つまたはそれより多いモノマーリガンドを含む。]
[0214] ホモポリマーリガンドは、セリン、トレオニン、またはチロシンなどの脱リン酸化可能な残基がモノマーリガンドの1つまたは複数において置換または改変されてもよいことを除き、モノマーリガンドの各々がアミノ酸配列において同一であるポリマーリガンドである。改変には、偽リン酸化残基（酸性アミノ酸）への置換、または中性残基への置換が含まれるがこれらに限定されるわけではない。]
[0215] ヘテロポリマーリガンドは、モノマーリガンドのいくつかが同一のアミノ酸配列を有しないポリマーリガンドである。]
[0216] 本発明のリガンドは任意で、エピトープタグ、レポーター、および／または細胞局在化シグナルを提供する追加の分子またはアミノ酸に連結される。細胞局在化シグナルはリガンドを細胞の領域に標的化する。エピトープタグおよび／またはレポーターおよび／または局在化シグナルは同じ分子であってもよい。エピトープタグおよび／またはレポーターおよび／または局在化シグナルはまた、異なる分子であってもよい。]
[0217] 本発明はまた、リガンド、ホモポリリガンド、およびへテロポリリガンドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明の核酸は任意で、エピトープタグ、レポーター、および／または細胞局在化シグナルなどの追加の特色を有するポリペプチドをコードする追加のヌクレオチド配列に連結される。ポリヌクレオチドは任意で、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むヌクレオチド配列および制限エンドヌクレアーゼ活性にとって必要な他のヌクレオチドに隣接する。隣接配列は任意で、ベクター内で独自のクローニング部位を提供し、任意でサブシークエンスのクローニングの方向性を提供する。さらに、本発明の核酸は任意でベクターポリヌクレオチドに組み入れられる。本発明のリガンド、ポリリガンド、およびポリヌクレオチドは、研究ツールおよび／または治療物質として有用性を有する。]
[0218] 本発明の追加の態様には、PAI-1の任意の推定または実際の相互作用パートナーに基づくモノマー（先に記述した）が含まれる。さらに、基質または結合タンパク質が1つより多い認識モチーフを有する場合、1つより多いモノマーがそこで同定されてもよい。]
[0219] 本発明のもう1つの態様は、リガンドペプチドの少なくとも1コピーをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子である。]
[0220] 本発明のもう1つの態様は、ポリヌクレオチド配列が1つまたは複数のペプチドリガンドの1つまたは複数のコピーをコードする核酸分子である。]
[0221] 本発明のもう1つの態様は、ポリヌクレオチド配列が、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10からなる群より選択される数のペプチドのコピーをコードする核酸分子である。]
[0222] 本発明のもう1つの態様は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも1コピーをコードする核酸分子を含むベクターである。]
[0223] 本発明のもう1つの態様は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも1コピーをコードする核酸分子を含むベクターを含む組み換え型宿主細胞である。]
[0224] 本発明のもう1つの態様は、リガンドまたはポリリガンドの少なくとも1コピーをコードする核酸分子を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトする段階、およびトランスフェクトされた宿主細胞をリガンドまたはポリリガンドの少なくとも1コピーを産生するために適した条件で培養する段階を含む、宿主細胞においてPAI-1を阻害する方法である。]
[0225] 本発明のもう1つの局面は、PAI-1リガンドまたはポリリガンドの少なくとも1コピーをコードする核酸分子を含むベクターを被験体の心組織に注入する段階を含む、被験体の心組織におけるPAI-1を阻害する方法である。]
[0226] 本発明のもう1つの局面は、PAI-1リガンドまたはポリリガンドの少なくとも1コピーをコードする核酸分子を含むベクターを受精卵または胚幹細胞に注入する段階を含む、低減されたPAI-1活性を有するトランスジェニック被験体を作製する方法である。]
[0227] 本発明はまた、参照阻害因子に対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である改変阻害因子にも関する。「改変阻害因子」は、阻害因子タンパク質またはポリペプチドの一次構造（アミノ酸配列）における1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換によって作製されうるペプチドを意味するために用いられる。「改変認識モチーフ」は、モチーフの一次構造（アミノ酸配列）における1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換によって改変されている天然に存在するPAI-1認識モチーフである。「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。参照阻害因子は、必ずしも野生型タンパク質またはその一部ではない。このように、参照阻害因子は、その配列が野生型タンパク質に対して既に改変されたタンパク質またはペプチドであってもよい。参照阻害因子は、特定の生物からの野生型タンパク質であってもよく、そうでなくてもよい。]
[0228] 参照アミノ酸配列に対して少なくともたとえば約95％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、アミノ酸配列に、参照ペプチドをコードする参照アミノ酸配列のアミノ酸100個毎に約5個までの改変が含まれてもよいことを除き、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意味すると理解される。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも約95％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の約5％までが欠失もしくはもう1つのアミノ酸によって置換されてもよく、または参照配列における総アミノ酸の約5％までの数のアミノ酸が、参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のN-末端もしくはC-末端位置で起こってもよく、それらの末端位置のあいだのどこかで起こってもよく、参照配列におけるアミノ酸のあいだに個々に散在してもよく、または参照配列内の1つもしくは複数の連続する群に散在してもよい。]
[0229] 本明細書において用いられるように、「同一性」は、参照ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した場合にヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般的に、配列は、最高次数のマッチングが得られるようにアラインメントされる。「同一性」そのものは、当技術分野において認識された意味を有し、公表された技術を用いて計算することができる。（たとえば、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；von Heinje, G., Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press (1987)；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York (1991)を参照されたい）。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のあいだの同一性を測定するいくつかの方法が存在するが、「同一性」という用語は当業者に周知である（Carillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988)）。2つの配列間の同一性または類似性を決定するために最も一般的に使用される方法には、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994)およびCarillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988)において開示される方法が含まれるがこれらに限定されるわけではない。コンピュータープログラムはまた、同一性および類似性を計算する方法およびアルゴリズムを含有してもよい。2つの配列間の同一性および類似性を決定するためのコンピュータープログラム法の例には、GCGプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(i):387 (1984)）、BLASTP、ExPASy、BLASTN、FASTA（Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)）、およびFASTDBが含まれるがこれらに限定されるわけではない。同一性および類似性を決定するための方法の例は、参照により本明細書に組み入れられる、Michaels, G. and Garian, R., Current Protocols in Protein Science, Vol 1, John Wiley & Sons, Inc. (2000)において考察される。本発明の1つの態様において、2つまたはそれより多いポリペプチド間の同一性を決定するために用いられるアルゴリズムはBLASTPである。]
[0230] 本発明のもう1つの態様において、2つまたはそれより多いポリペプチド間の同一性を決定するために用いられるアルゴリズムは、 Brutlag et al.（Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)、参照により本明細書に組み入れられる）のアルゴリズムに基づくFASTDBである。FASTDB配列アラインメントにおいて、問い合わせおよび対象配列はアミノ配列である。配列アラインメントの結果は％同一性である。％同一性を計算するためのアミノ酸配列のFASTDBアラインメントにおいて用いられてもよいパラメータには、行列＝PAM、k-tuple＝2、ミスマッチペナルティ＝1、結合ペナルティ＝20、無作為化グループ長＝0、カットオフスコア＝1、ギャップペナルティ＝5、ギャップサイズペナルティ 0.05、ウィンドウサイズ＝500または対象アミノ酸配列の長さのどちらか短いほうが含まれるがこれらに限定されるわけではない。]
[0231] 内部付加または欠失のためではなくてN-末端またはC-末端の付加または欠失のために、対象配列が問い合わせ配列より短いまたは長い場合、FASTDBプログラムは、％同一性の計算にあたって対象配列のN-末端およびC-末端切断または付加を考慮に入れないことから、手動での補正を行うことができる。問い合わせ配列と比較して双方の端部で切断された対象配列の場合、％同一性は、マッチング／アラインメントしていない参照配列に対してN-およびC-末端である問い合わせ配列の塩基数を問い合わせ配列の総塩基の百分率として計算することによって補正される。FASTDB配列アラインメントの結果は、マッチング／アラインメントを決定する。次に、アラインメントの百分率を％同一性から差し引いて、明記されたパラメータを用いて上記のFASTDBプログラムによって計算して、最終的な％同一性スコアに達する。この補正されたスコアは、アラインメントが互いにどのように「対応する」かのみならず、％同一性を決定する目的のために用いることができる。参照または対象配列のN-またはC-末端を超えて伸長する問い合わせ（対象）配列または参照配列の残基はそれぞれ、％同一性スコアを手動で調節する目的のために考慮されてもよい。すなわち、％同一性スコアまたはアラインメント番号付けを手動で調節する場合には、比較配列のN-またはC-末端でマッチングしていない／アラインメントしていない残基を計数してもよい。]
[0232] たとえば、アミノ酸残基90個の対象配列を、％同一性を決定するために、残基100個の参照配列とアラインメントさせる。欠失は、対象配列のN-末端で起こり、ゆえに、FASTDBアラインメントはN-末端の最初の残基10個のマッチング／アラインメントを示さない。非対残基10個は配列の10％であり（マッチングしていないN-およびC-末端での残基数／問い合わせ配列における残基の総数）、そのため10％がFASTDBプログラムによって計算された％同一性スコアから差し引かれる。残りの残基90個が完全にマッチングする場合、最終的な％同一性は90％であろう。もう1つの例において、90残基の対象配列を100残基の参照配列と比較する。この場合、欠失は内部欠失であり、そのため対象配列のN-またはC-末端で問い合わせとマッチング／アラインメントしていない残基は存在しない。この場合、FASTDBによって計算された％同一性は手動で補正されない。]
[0233] 本発明のポリリガンドは任意で、モノマーの前、後、またはあいだにスペーサーアミノ酸を含む。スペーサーの長さおよび組成は多様であってもよい。スペーサーの例は、グリシン、アラニン、ポリグリシン、またはポリアラニンである。時に、ポリペプチドの二次構造を中断する目的のためにスペーサーにプロリンを使用することが望ましい。スペーサーアミノ酸は、任意のアミノ酸であってもよく、アラニン、グリシン、およびプロリンに限定されない。例示的なスペーサーは、SEQID NO:53〜56に提供される。本発明は、スペーサーを伴うまたは伴わない、ホモポリリガンドとヘテロポリリガンドの全ての組み合わせに向けられ、上記または下記で与えられた例に限定されない。]
[0234] 本発明のリガンドおよびポリリガンドは任意で、細胞の領域にリガンドを局在させるシグナルに連結される。細胞局在化シグナルの非制限的な例は、筋小胞体、小胞体、細胞外マトリクス、ミトコンドリア、ゴルジ体、ペルオキシソーム、ライソソーム、核、核小体、エンドソーム、エキソソーム、他の細胞内小胞、形質膜、頂端膜、および側底膜に局在するシグナルである。1つの態様において、リガンドおよびポリリガンドは、米国特許仮出願第60/957,328号において記述されるシグナルなどの非細胞特異的形質膜局在化シグナルを通して細胞外面に送達される。他の態様において、リガンドおよびポリリガンドは、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、および心筋細胞の筋細胞膜に特異的な局在化シグナルなどの細胞特異的局在化シグナルについて細胞外の面に送達される。他の態様において、リガンドおよびポリリガンドは、コラーゲン結合タンパク質などの細胞外会合ドメインを通して細胞外マトリクスに、または心筋梗塞領域において濃縮された他の細胞外成分に送達される。図3A〜3H、5A〜5I、11A〜11I、および22A〜22Fは、局在化シグナルに連結したリガンドおよびポリリガンドの例示的な構成を示す。局在化シグナルは例によって与えられ、制限ではない。]
[0235] 本発明の1つの態様は、クラス1局在化テザーに連結されたリガンドまたはポリリガンドである。]
[0236] 本発明のもう1つの態様は、クラス2局在化テザーに連結されたリガンドまたはポリリガンドである。]
[0237] 本発明のもう1つの態様は、クラス3局在化テザーに連結されたリガンドまたはポリリガンドである。]
[0238] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されたクラス1局在化テザーである。]
[0239] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるクラス1局在化テザーと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるクラス1局在化テザーである。]
[0240] 本発明のもう1つの態様は、1つまたは複数のアミノ酸欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含むように改変されている、本明細書において記述されるクラス1局在化テザーである。]
[0241] 本発明のもう1つの態様は、SEQID NO:57〜76と少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるクラス1局在化テザーである。]
[0242] 本発明のもう1つの態様は、SEQID NO:77〜95の1つと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である少なくとも1つのペプチドを含むクラス1局在化テザーである。]
[0243] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるクラス1局在化テザーをコードするポリヌクレオチドである。]
[0244] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるクラス2局在化テザーである。]
[0245] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるクラス2局在化テザーをコードするポリヌクレオチドである。]
[0246] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるクラス3局在化テザーである。]
[0247] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるクラス3局在化テザーと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるクラス3局在化テザーである。]
[0248] 本発明のもう1つの態様は、1つまたは複数のアミノ酸欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含むように改変されている、本明細書において記述されるクラス3局在化テザーである。]
[0249] 本発明のもう1つの態様は、SEQID NO:100〜111と少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるクラス3局在化テザーである。]
[0250] 本発明のもう1つの態様は、SEQID NO:112〜128の1つと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である少なくとも1つのペプチドを含むクラス3局在化テザーである。]
[0251] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるクラス3局在化テザーをコードするポリヌクレオチドである。]
[0252] 本発明のリガンドおよびポリリガンドは、その活性を制限するためにデグロンに連結されてもよい。図21A〜21Hおよび22A〜22Fは、デグロンに連結されたリガンドおよびポリリガンドのいくつかの非制限的な態様を示す。]
[0253] さらに、本発明のリガンドおよびポリリガンドは、任意で、エピトープタグまたはレポーターを提供する追加の分子またはアミノ酸に連結される（図4A〜4Gを参照されたい）。エピトープタグの非制限的な例は、FLAGTM、HA（血液凝集素）、c-Myc、およびHis6である。レポーターの非制限的な例は、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質である。エピトープおよびレポーターは例として与えられ、制限ではない。エピトープタグおよび／またはレポーターは、同じ分子であってもよい。エピトープタグおよび／またはレポーターはまた異なる分子であってもよい。]
[0254] リガンドおよびポリリガンド、ならびにそれに連結した任意のアミノ酸は、当技術分野において公知の技術を用いて化学的または組み換えによって合成されうる。化学合成技術には、自動ペプチドシンセサイザーを用いてしばしば行われるペプチド合成が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ペプチドはまた、当技術分野において公知の非自動ペプチド合成法を用いて合成されうる。組み換え技術には、核酸発現産物が細胞因子およびプロセスを用いて合成される、リガンドコード核酸の発現ベクターへの挿入が含まれる。]
[0255] 細胞局在化シグナル、エピトープタグ、レポーター、またはデグロンのリガンドまたはポリリガンドへの連結には、リガンドに対する共有結合的連結または酵素的連結が含まれうる。局在化シグナルが脂質または炭水化物などのポリペプチド以外の材料を含む場合、分子を連結させる化学反応を利用してもよい。加えて、非標準的なアミノ酸、および脂質、炭水化物、リン酸塩、または他の分子によって改変されたアミノ酸をペプチド合成の前駆体として用いてもよい。本発明のリガンドは、局在化シグナルの存在下または非存在下で治療的有用性を有する。しかし、局在化シグナルに連結したリガンドは、細胞内ツールまたは治療物質として有用性を有する。]
[0256] 図6A〜6E、13A〜13Eおよび23A〜23Gは、PAI-1リガンド含有遺伝子構築物の例を示す。PAI-1リガンド含有遺伝子構築物は、本明細書において記述されるウイルスまたは非ウイルスベクターによって送達されてもよい。図7Bおよび7Cは、インビボでポリペプチド発現を送達および制御するための遺伝子治療ベクターの態様を描写する。図7Bおよび7Cにおける遺伝子構築物に連結されたポリヌクレオチド配列には、ウイルスゲノムおよび／または宿主ゲノムへのトランスジーンの組み込みを容易にするためにゲノム組み込みドメインが含まれる。AttPおよびAttB配列は、ゲノム組み込み配列の非制限的な例である。]
[0257] 図7Aは、リガンド遺伝子構築物が、トランスジェニック動物を生成するために有用な単位としてベクターから放出可能である、PAI-1リガンド遺伝子構築物を含有するベクターを示す。たとえば、リガンド遺伝子構築物またはトランスジーンは、制限エンドヌクレアーゼ消化によってベクター骨格から放出される。次に、放出されたトランスジーンをマウス受精卵の前核に注入するか、またはトランスジーンは胚幹細胞を形質転換するために用いられる。図7Aのリガンド遺伝子構築物を含有するベクターはまた、トランスジーンの一過性のトランスフェクションにとっても有用であり、トランスジーンのプロモーターおよびコドンは宿主生物に関して最適化される。図7Aのリガンド遺伝子構築物を含有するベクターはまた、プロモーターおよびトランスジーンのコドンが発酵宿主生物に関して最適化される、小規模または大規模産生のために適合可能である発酵可能な生物におけるポリペプチドの組み換え的発現にとって有用である。]
[0258] 図7Dは、安定な細胞株を生成するために有用なPAI-1リガンド遺伝子構築物を含有するベクターを示す。]
[0259] 本発明はまた、リガンドおよびポリリガンドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは任意で、デグロン、局在化シグナル、エピトープ、またはレポーターをコードする追加のヌクレオチド配列に連結される。さらに、本発明の核酸は、任意でベクターポリヌクレオチドに組み入れられる。ポリヌクレオチドは任意で、制限エンドヌクレアーゼ部位および制限エンドヌクレアーゼ活性にとって必要な他のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によって隣接される。隣接配列は任意で、ベクター内でクローニング部位を提供する。制限部位には、ほとんどの市販のクローニングベクターにおいて一般的に用いられる任意の部位が含まれうるがこれらに限定されるわけではない。ホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる他の制限酵素による切断のための部位も同様に、この目的のために用いられる。ポリヌクレオチド隣接配列はまた任意で、サブシークエンスクローニングの方向性を提供する。5'および3'制限エンドヌクレアーゼ部位は、二本鎖DNAがクローニングベクターの対応する相補的部位に方向性にクローニングされうるように、互いに異なることが好ましい。]
[0260] デグロン、局在化シグナル、エピトープ、またはレポーターを伴うまたは伴わないリガンドおよびポリリガンドは、または組み換え技術によって合成される。所望の成分を含有して発現ベクターに挿入されるポリヌクレオチド発現構築物が作出される。次に、発現ベクターを細胞にトランスフェクトして、ポリペプチド産物を発現させて単離する。組み換えDNA技術に従って作出されたリガンドは、研究ツールおよび／または治療物質として有用性を有する。]
[0261] 以下はリガンドおよびポリリガンドをコードするポリヌクレオチドがどのように産生されるかの例である。リガンドおよび隣接配列をコードする相補的オリゴヌクレオチドを合成してアニーリングする。得られた二本鎖DNA分子を、当技術分野において公知の技術を用いてクローニングベクターに挿入する。リガンドおよびポリリガンドをトランスジェニック遺伝子構築物内でタンパク質産物に翻訳される配列に近接してインフレームで配置すると、それらは、細胞またはトランスジェニック動物において発現された場合に融合タンパク質の一部を形成する。]
[0262] 本発明のもう1つの態様は、望ましい細胞、組織、または生理的状態におけるPAI-1リガンドまたはポリリガンド発現を選択的に制御するための遺伝子構築物に関する。例示的な遺伝子構築物の構成を図6A〜6Eに示す。遺伝子構築物のプロモーター部分は、構成的プロモーター、非構成的プロモーター、組織特異的プロモーター（構成的または非構成的）、または誘導型プロモーターでありうる。本発明にとって有用な組織特異的プロモーターの非制限的な例は、内皮細胞特異的プロモーター（White, SJ, et al., Gene Ther. 2007 Nov 8 [出版前電子出版]）、血管平滑筋細胞特異的プロモーター（Ribault, S,Circ Res., 2001, 88(5):468-75；Appleby, CE, et al., Gene Ther. 2003, 10(18): 1616-22）、心筋細胞特異的プロモーター（Xu, L, et al., J Biol Chem., 2006, 281(45):34430-40）、冠動脈脂肪細胞特異的プロモーター、および心線維芽細胞特異的プロモーターである。心臓および低酸素症特異的プロモーター（Su, H, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(46): 16280-5）などの複合的な組織および状態特異的プロモーターは、それらが心筋梗塞領域においてリガンドまたはポリリガンドを発現させるであろうことから、本発明にとって特に有用である。誘導型プロモーターは、薬物または他の因子によって活性化される。RHEOSWITCHは、New England BioLabs（Ipswich, MA）から入手可能な、本発明にとって有用である誘導型プロモーターである。本発明の態様は、その発現が誘導型プロモーターシステムによって制御されるリガンドまたはポリリガンド遺伝子構築物を含む。]
[0263] 本発明の1つの態様は、組織特異的プロモーターに連結したリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドである。]
[0264] 本発明のもう1つの態様は、動脈平滑筋特異的プロモーターに連結したリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドである。]
[0265] 本発明のもう1つの態様は、血管平滑筋細胞特異的プロモーターに連結したリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドである。]
[0266] 本発明のもう1つの態様は、内皮細胞特異的プロモーターに連結したリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドである。]
[0267] 本発明のもう1つの態様は、合成内皮細胞特異的プロモーターに連結したリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドである。]
[0268] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述される組織特異的プロモーターをコードするポリヌクレオチドである。]
[0269] 本発明のもう1つの態様は、1つまたは複数のヌクレオチド欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含むように改変されている本明細書において記述される組織特異的プロモーターをコードするポリヌクレオチドである。]
[0270] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述される組織特異的プロモーターと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である組織特異的プロモーターをコードするポリヌクレオチドである。]
[0271] 本発明のもう1つの態様は、SEQID NO:132〜139において示されるポリヌクレオチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるポリヌクレオチドである。]
[0272] ポリリガンドは天然においてモジュール型である。本発明の1つの局面は、開示されたポリリガンドの複合モジュール性である。本発明のもう1つの局面は、これらのモジュール型リガンドを容易にかつ簡便に作出する方法である。この点において、本発明の態様は、遺伝子発現成分のモジュール型クローニング法を含む。リガンド、ホモポリリガンド、ヘテロポリリガンドおよび任意でアミノ酸発現成分が組み換えによって合成される場合、各々のクローニング可能なエレメントをモジュールとして見なすことができる。クローニングの速度および簡便さのために、付着末端に適合性であって、連続的に挿入およびクローニングすることが容易であるモジュールエレメントを作出することが望ましい。これは、制限エンドヌクレアーゼ部位認識および切断に関する天然の特性を利用することによって成就される。本発明の1つの局面は、モジュールの一端で制限酵素消化のために1回利用され、他の端部で望ましければ何回も制限酵素消化のために利用されるモジュール型隣接配列を包含する。言い換えれば、モジュールの1つの端部での制限部位は、モジュールエレメントの連続的クローニングを行うために利用されて破壊される。コード領域モジュールに隣接する制限部位の例は、制限酵素NgoM IVおよびCla I；またはXma IおよびCla Iによって認識される配列である。第一の環状DNAをNgoM IVおよびCla Iによって切断して5' NgoM IV突出末端および3' ClaI突出末端を有する直線状DNAを生じる段階；ならびに第二の環状DNAをXma IおよびCla Iによって切断して5' Cla I突出末端および3' Xma I突出末端とを有する直線状のDNAを生じる段階によって、適合性の付着末端を有する第一および第二のDNA断片が生成される。これらの第一および第二のDNA断片を共に混合して、アニーリングし、およびライゲーションすると、第三の環状DNA断片を形成して、第一のDNAに存在したNgoM IV部位および第二のDNAに存在したXma I部位は、第三の環状DNAにおいて破壊される。このDNAの痕跡領域はさらなるXma IまたはNgoM IV消化から保護されるが、第三の環状DNAにおいて残っている隣接配列はなおも無傷の5' NgoM IVおよび3' Cla I部位を含有する。このプロセスを多数回繰り返すと、方向性の、連続性の、モジュール性のクローニング事象を達成することができる。NgoM IV、Xma I、およびCla Iエンドヌクレアーゼによって認識される制限部位は、隣接配列として用いられる場合に連続的なクローニングを許容する一群の部位である。]
[0273] コード領域モジュールを方向性におよび連続的にアセンブルするもう1つの方法は、環状DNAのほかに直線状DNAを使用する。たとえば、上記の連続的クローニングプロセスと同様に、コード領域モジュールに隣接する制限部位は、制限酵素NgoM IVおよびCla I、またはXma IおよびCla Iによって認識される配列である。第一の環状DNAをNgoM IVおよびCla Iによって切断すると、5' NgoM IV突出末端および3' Cla I突出末端を有する直線状DNAを生じる。第二の直線状の二本鎖DNAは、PCR増幅によってまたは相補的オリゴヌクレオチドを合成してアニーリングすることによって生成される。第二の環状DNAは5' Cla I突出末端および3' Xma I突出末端を有し、それらは第一の直線状DNAと適合性の付着末端を有する。これらの第一および第二のDNA断片を共に混合して、アニーリングして、およびライゲーションすると、第三の環状DNA断片が形成されて、第一のDNAに存在したNgoM IV部位および第二のDNAに存在したXma I部位は、第三の環状DNAにおいて破壊される。第三の環状DNAにおいて残っている隣接配列はなおも、無傷の5' NgoM IVおよび3' Cla I部位を含有する。このプロセスを多数回繰り返すと、方向性の、連続性のモジュール性のクローニング事象を達成することができる。NgoM IV、Xma IおよびCla Iエンドヌクレアーゼによって認識される制限部位は、隣接配列として用いられた場合に連続的クローニングを許容する一群の部位である。このプロセスを図8に描写する。]
[0274] 当業者は、他の制限部位群が、本明細書において記述される連続的な、方向性のクローニングを達成できることを認識する。制限エンドヌクレアーゼ選択にとって好ましい基準は、適合性の付着末端を生じるが、その部位が互いとのライゲーションによって破壊されるエンドヌクレアーゼの対を選択することである。もう1つの基準は、最初の2つのいずれかと適合性である平滑末端を生成しない第三のエンドヌクレアーゼ部位を選択することである。そのような基準を、連続的で方向性のクローニングのためのシステムとして利用する場合、リガンド、ポリリガンドおよび他のコード領域または発現成分は、望ましいように組み合わせてアセンブルされうる。同じ連続的プロセスをエピトープ、レポーター、デグロン、および／または局在化シグナルのために利用することができる。]
[0275] PAI-1活性をモジュレートするポリリガンドおよびポリリガンドを作出する方法を開示する。治療法には、局在化シグナルを伴うかまたは伴わない精製リガンドまたはポリリガンドを細胞に送達する段階が含まれる。または、局在化シグナルを伴うかまたは伴わない精製リガンドまたはポリリガンドは、細胞においてタンパク質産物の発現を提供する、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他のウイルスもしくはレトロウイルス構築物を使用する構築物などのウイルスまたはレトロウイルス構築物によって送達される。]
[0276] PAI-1リガンドまたはポリリガンド、PAI-1リガンドおよびポリリガンドをコードする核酸、ならびにPAI-1リガンドおよびポリリガンドをコードする核酸を含有するベクターを用いて、線維症状態を有する被験体または線維症発症のリスクを有する被験体を処置することができる。被験体は、天然に存在する線維症状態、または手術によって誘導された、化学物質によって誘導された、遺伝的に誘導された、もしくは他の実験的に誘導された線維症状態を有する動物であってもよい。線維症状態は、化学物質曝露、食餌の操作、遺伝的操作、肥満、または自然成熟によって誘導される糖尿病または高血糖症に起因してもよい。線維症状態はまた、高血圧症、虚血、壊死、免疫媒介損傷、タバコの煙の曝露、化学物質曝露、繊維の曝露、ウイルスもしくは細菌感染症、または特発的原因に起因してもよい。PAI-1リガンドまたはポリリガンド、PAI-1リガンドおよびポリリガンドをコードする核酸、ならびにPAI-1リガンドおよびポリリガンドをコードする核酸を含有するベクターは、線維症、ならびに心臓、血液、腎臓、肝臓、肺、および卵巣における他のPAI-1関連障害を処置するために用いられうる。PAI-1リガンドまたはポリリガンド、PAI-1リガンドおよびポリリガンドをコードする核酸、ならびにPAI-1リガンドおよびポリリガンドをコードする核酸を含有するベクターはまた、PAI-1が発現される様々な癌を処置するために有用である可能性がある。]
[0277] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述される心血管組織にリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドを移入するための方法である。]
[0278] 本発明のもう1つの態様は、以下の1つを含む、リガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドを心血管組織に移入するための方法である：アデノウイルスの局所注入、単球のエクスビボ形質導入、または大動脈への直接注入。]
[0279] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述される不安定プラークの形成におけるPAI-1の機能を査定するための方法である。]
[0280] 本発明のもう1つの態様は、インスリン耐性マウスモデルを開発する段階を含む、不安定プラークの形成におけるPAI-1の機能を査定するための方法である。]
[0281] 本発明のもう1つの態様は、本明細書において記述されるリガンドまたはポリリガンドの空間的または時間的制御を達成する方法である。]
[0282] 本発明のもう1つの態様は、リガンドまたはポリリガンドを組織特異的プロモーターに連結させる段階を含む、リガンドまたはポリリガンドの空間的制御を達成する方法である。]
[0283] 本発明のもう1つの態様は、リガンドまたはポリリガンドを局在化テザーに連結させる段階を含む、リガンドまたはポリリガンドの空間的制御を達成する方法である。]
[0284] 本発明のもう1つの態様は、リガンドまたはポリリガンドを誘導型遺伝子スイッチに連結させる段階を含む、リガンドまたはポリリガンドの時間的制御を達成する方法である。]
[0285] 本発明のもう1つの態様は、以下の段階を含む、心血管疾患を処置、予防、または改善するための方法である：
a）心血管疾患を有するまたは心血管疾患を発症するリスクを有する被験体を同定する段階；および
b）被験体にPAI-1リガンドまたはポリリガンドを投与する段階。]
[0286] 本発明のもう1つの態様は、以下の段階を含む、線維症状態を処置、予防、または改善するための方法である：
a）線維症状態を有するまたは線維症状態を発症するリスクを有する被験体を同定する段階；および
b）被験体にPAI-1リガンドまたはポリリガンドを投与する段階。]
[0287] 精製PAI-1リガンドは、経口もしくは非経口投与、局所投与のために、または錠剤、カプセル剤、もしくは液体剤形で、鼻腔内もしくは吸入エアロゾル、皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは他の注射のために；静脈内注入のために；または他の任意の投与経路のために製剤化されうる。さらに、リガンドをコードするヌクレオチド配列は、細胞において遺伝子産物を送達および発現するように設計されたベクターに組み込まれることができる。そのようなベクターには、プラスミド、コスミド、人工染色体、および改変ウイルスが含まれる。真核細胞への送達はインビボまたはエクスビボで成就されうる。エクスビボ送達法には、意図されるレシピエント細胞またはドナー細胞の単離、およびそれらの細胞へのベクターの送達後に細胞によるレシピエントの処置が含まれる。]
[0288] 本発明のもう1つの局面は、以下の段階を含む、アテローム性動脈硬化症を処置または予防するための方法である：
a）血管損傷を有するまたは血管損傷のリスクを有する被験体を同定する段階；
b）被験体から単球を単離する段階；
c）プロモーターに連結された線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを単球に導入して、改変細胞を産生する段階；および
d）被験体に改変細胞を導入する段階。]
[0289] 本発明のもう1つの態様は、プロモーターに連結した線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを被験体の単球に導入して、改変細胞を産生する段階を含む、被験体に線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータを送達するための改変細胞を調製する方法に関する。]
[0290] 本発明の1つの態様において、プロモーターは誘導型プロモーターである。本発明のもう1つの態様において、プロモーターはマクロファージ特異的プロモーターである。本発明のもう1つの態様において、プロモーターは泡沫細胞特異的プロモーターである。]
[0291] 本発明は、内皮および／または血管平滑筋細胞への薬物コーティングステントのカテーテルに基づく送達またはバルーン血管形成術媒介ウイルス送達の使用などのアテローム性動脈硬化症の処置のための現行の局所送達法に対していくつかの利点を提供する。デバイス媒介送達アプローチに関連する難しさに加えて、血管細胞タイプは、形質導入が難しい細胞であり、不良なトランスジーン発現を示すので、これらの細胞に対するトランスジーンの局所送達は非常に難しい。ゆえに、これらの方法は、多様な程度の有効性を有する。本発明は、血管損傷領域に帰巣する循環中の細胞タイプである単球を利用して、それによってタンパク質に基づく治療法のデバイス媒介局所送達の必要性をなくす。単球は、血管損傷部位でマクロファージに分化する。マクロファージはアテロームの局所環境に入ると、さらに泡沫細胞へと分化する。]
[0292] マクロファージは、アテローム性動脈硬化症発症のほとんどの相に関与している。ゆえに、それらは、線維素溶解経路のモジュレータを発現する、トランスジーンのアテローム性動脈硬化症病変部への局所送達にとって有用な細胞タイプとして現れる。これらの病変は血管全体に起こりうる。線維素溶解経路はアテローム性動脈硬化症の発症および進行において重要な役割を果たすことが示されているが、同様に止血作用においても重要な役割を果たす。ゆえに、本発明は、全身送達によっておそらく引き起こされうる制御されない出血などの有害事象を予防するために、この経路のモジュレータの空間的時間的制御を企図する。本発明の1つの態様において、時間的制御は、誘導型遺伝子スイッチを用いることを通して達成される。]
[0293] たとえば、本発明のもう1つの局面は、以下の段階を含む、アテローム性動脈硬化症を処置または予防するための方法である：
a）血管損傷を有するまたは血管損傷のリスクを有する被験体を同定する段階；
b）被験体から単球を単離する段階；
c）単球に、（1）化学リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（2）化学リガンド依存的転写因子によって活性化されるプロモーターに連結した線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入して、改変細胞を産生する段階；
d）改変細胞を被験体に導入する段階；ならびに
e）プロモーターを活性化するために被験体に化学リガンドを導入する段階。]
[0294] 本発明のもう1つの態様は、被験体の単球に、（a）化学リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（b）化学リガンド依存的転写因子によって活性化されるプロモーターに連結した線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入して、改変細胞を産生する段階を含む、被験体に線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータを送達するために改変細胞を調製する方法に関する。]

权利要求:

請求項1
本明細書において記述されるPAI-1リガンドまたはポリリガンド。
請求項2
本明細書において記述されるPAI-1リガンドまたはポリリガンドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるPAI-1リガンドまたはポリリガンド。
請求項3
1つまたは複数のアミノ酸欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含むように改変されている、本明細書において記述されるPAI-1リガンドまたはポリリガンド。
請求項4
SEQID NO:1〜30の奇数番号のSEQ ID NOにおいて示されるポリペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるポリペプチド。
請求項5
SEQID NO:37〜51の1つと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である少なくとも1つのペプチドを含むPAI-1リガンドまたはポリリガンド。
請求項6
以下の阻害機序の少なくとも1つを保有するPAI-1リガンドまたはポリリガンド：潜在状態、PA1の基質への変化、tPA結合に対する立体障害、内因性のビトロネクチンに対する立体障害、または結合部位に対する直接競合。
請求項7
断片が任意で、1つまたは複数のアミノ酸欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含む、SEQID NO:31〜36において示される親タンパク質の少なくとも1つの断片を含む、PAI-リガンドまたはポリリガンド。
請求項8
以下からなる群より選択されるペプチドの少なくとも1コピーを含むPAI-1の阻害因子：a）SEQID NO:31のアミノ酸残基354〜368位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；b）SEQ ID NO:31のアミノ酸残基300〜309位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；c）SEQ ID NO:31のアミノ酸残基343〜353位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；d）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；e）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基32位に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンからロイシンに変異しているペプチド；f）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基29位に対応するアミノ酸残基がトレオニンからアラニンに変異しているペプチド；g）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基42位に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸からアラニンに変異しているペプチド；h）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基43位に対応するアミノ酸残基がロイシンからアラニンに変異しているペプチド；i）SEQ ID NO:32のアミノ酸残基20〜63位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基23位に対応するアミノ酸残基がセリンからフェニルアラニンに変異しており、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基52位に対応するアミノ酸残基がトレオニンからグルタミン酸に変異しており、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基53位に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸からロイシンに変異しており、SEQ ID NO:32のアミノ酸残基56位に対応するアミノ酸残基がアラニンからチロシンに変異しており、かつSEQ ID NO:32のアミノ酸残基57位に対応するアミノ酸残基が、グルタミン酸からチロシンに変異しているペプチド；j）SEQ ID NO:33のアミノ酸残基25〜256位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；k）SEQ ID NO:33のアミノ酸残基25〜44位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；l）SEQ ID NO:33のアミノ酸残基47〜256位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；m）SEQ ID NO:34のアミノ酸残基301〜308位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるペプチド；n）SEQ ID NO:35のアミノ酸残基29〜121位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基55位に対応するアミノ酸残基がバリンからアラニンに変異しており、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基57位に対応するアミノ酸残基がアスパラギンからチロシンに変異しており、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基59位に対応するアミノ酸残基がトレオニンからアスパラギンに変異しており、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基79位に対応するアミノ酸残基がセリンからリジンに変異しており、SEQ ID NO:35のアミノ酸残基81位に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸からリジンに変異しており、かつSEQ ID NO:35のアミノ酸残基83位に対応するアミノ酸残基がグリシンからグルタミン酸に変異しているペプチド；ならびにo）SEQ ID NO:36のアミノ酸残基179〜415位に対応するアミノ酸残基を含むペプチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であって、SEQ ID NO:36のアミノ酸残基224位に対応するアミノ酸残基がヒスチジンからアラニンに変異しており、SEQ ID NO:36のアミノ酸残基275位に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸からアラニンに変異しており、かつSEQ ID NO:36のアミノ酸残基376位に対応するアミノ酸残基がセリンからアラニンに変異しているペプチド。
請求項9
請求項1〜8記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項10
SEQID NO:1〜30の偶数SEQ ID NOにおいて示されるポリヌクレオチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるポリヌクレオチド。
請求項11
クラス1局在化テザーに連結されたリガンドまたはポリリガンド。
請求項12
クラス2局在化テザーに連結されたリガンドまたはポリリガンド。
請求項13
クラス3局在化テザーに連結されたリガンドまたはポリリガンド。
請求項14
請求項11〜13記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項15
本明細書において記述されるクラス1局在化テザー。
請求項16
本明細書において記述されるクラス1局在化テザーと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるクラス1局在化テザー。
請求項17
1つまたは複数のアミノ酸欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含むように改変されている、本明細書において記述されるクラス1局在化テザー。
請求項18
SEQID NO:57〜76と少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるクラス1局在化テザー。
請求項19
SEQID NO:77〜95の1つと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である少なくとも1つのペプチドを含むクラス1局在化テザー。
請求項20
請求項15〜19記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項21
本明細書において記述されるクラス2局在化テザー。
請求項22
請求項21記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項23
本明細書において記述されるクラス3局在化テザー。
請求項24
本明細書において記述されるクラス3局在化テザーと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるクラス3局在化テザー。
請求項25
1つまたは複数のアミノ酸欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含むように改変されている、本明細書において記述されるクラス3局在化テザー。
請求項26
SEQID NO:100〜111と少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるクラス3局在化テザー。
請求項27
SEQID NO:112〜128の1つと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である少なくとも1つのペプチドを含むクラス3局在化テザー。
請求項28
請求項23〜27記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項29
組織特異的プロモーターに連結されたリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチド。
請求項30
動脈平滑筋特異的プロモーターに連結されたリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチド。
請求項31
血管平滑筋細胞特異的プロモーターに連結されたリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチド。
請求項32
内皮細胞特異的プロモーターに連結されたリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチド。
請求項33
合成内皮細胞特異的プロモーターに連結されたリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチド。
請求項34
本明細書において記述される組織特異的プロモーターをコードするポリヌクレオチド。
請求項35
1つまたは複数のヌクレオチド欠失、置換、挿入、切断、またはその組み合わせを含むように改変されている、本明細書において記述される組織特異的プロモーターをコードするポリヌクレオチド。
請求項36
本明細書において記述される組織特異的プロモーターと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である組織特異的プロモーターをコードするポリヌクレオチド。
請求項37
SEQID NO:132〜139において示されるポリヌクレオチドと少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるポリヌクレオチド。
請求項38
本明細書において記述される心血管組織に、リガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドを移入するための方法。
請求項39
以下の1つを含む、心血管組織にリガンドまたはポリリガンドをコードするポリヌクレオチドを移入するための方法：アデノウイルスの局所注入、単球のエクスビボ形質導入、または大動脈への直接注入。
請求項40
本明細書において記述される不安定プラークの形成におけるPAI-1の機能を査定するための方法。
請求項41
インスリン耐性マウスモデルを開発する段階を含む、不安定プラークの形成におけるPAI-1の機能を査定するための方法。
請求項42
本明細書において記述されるリガンドまたはポリリガンドの空間的または時間的制御を達成する方法。
請求項43
リガンドまたはポリリガンドを組織特異的プロモーターに連結させる段階を含む、リガンドまたはポリリガンドの空間的制御を達成する方法。
請求項44
リガンドまたはポリリガンドを局在化テザーに連結させる段階を含む、リガンドまたはポリリガンドの空間的制御を達成する方法。
請求項45
リガンドまたはポリリガンドを誘導型遺伝子スイッチに連結させる段階を含む、リガンドまたはポリリガンドの時間的制御を達成する方法。
請求項46
以下の段階を含む、心血管疾患を処置、予防、または改善するための方法：a）心血管疾患を有するまたは心血管疾患を発症するリスクを有する被験体を同定する段階；およびb）PAI-1リガンドまたはポリリガンドを被験体に投与する段階。
請求項47
以下の段階を含む、線維症状態を処置、予防、または改善するための方法：a）線維症状態を有するまたは線維症状態を発症するリスクを有する被験体を同定する段階；およびb）PAI-1リガンドまたはポリリガンドを被験体に投与する段階。
請求項48
以下の段階を含む、アテローム性動脈硬化症を処置または予防するための方法：a）血管損傷を有するまたは血管損傷のリスクを有する被験体を同定する段階。b）被験体から単球を単離する段階；c）プロモーターに連結された線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを単球に導入して、改変細胞を産生する段階；およびd）改変細胞を被験体に導入する段階。
請求項49
プロモーターに連結した線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを被験体の単球に導入して、改変細胞を産生する段階を含む、被験体に線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータを送達するために改変細胞を調製する方法。
請求項50
以下を含む、アテローム性動脈硬化症を処置または予防するための方法：a）血管損傷を有するまたは血管損傷のリスクを有する被験体を同定する段階；b）被験体から単球を単離する段階；c）単球に、（1）化学リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（2）化学リガンド依存的転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入して、改変細胞を産生する段階；d）被験体に改変細胞を導入する段階；ならびにe）プロモーターを活性化するために被験体に化学リガンドを導入する段階。
請求項51
被験体の単球に、（a）化学リガンド依存的転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列を含む遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド、および（b）化学リガンド依存的転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入して、改変細胞を産生する段階を含む、被験体に線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータを送達するための改変細胞を調製する方法。
請求項52
転写因子配列がマクロファージ特異的調節エレメントに連結される、請求項50記載の方法。
請求項53
転写因子配列が、マクロファージ特異的調節エレメントに連結される、請求項51記載の方法。
請求項54
線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータが、請求項1〜8のいずれか一項記載のPAI-1リガンドまたはポリリガンドである、請求項48〜53のいずれか一項記載の方法。
請求項55
線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータがPAI-1阻害因子である、請求項48〜53のいずれか一項記載の方法。
請求項56
線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータが天然のプラスミノーゲン活性化因子である、請求項48〜53のいずれか一項記載の方法。
請求項57
線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータが変異体プラスミノーゲン活性化因子である、請求項48〜53のいずれか一項記載の方法。
請求項58
線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータがプラスミノーゲン活性化因子断片である、請求項48〜53のいずれか一項記載の方法。
請求項59
以下を含む、固定マクロファージ集団を伴う線維症状態を処置、予防、または改善するための方法：a）線維症状態を有するまたは線維症状態を発症するリスクを有する被験体を同定する段階；b）被験体から単球を単離する段階；c）固定マクロファージ集団に特異的な調節エレメントに連結された線維素溶解経路のポリペプチドモジュレータをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを単球に導入して、改変細胞を産生する段階；およびd）改変細胞を被験体に導入する段階。
請求項60
段階b）およびd）がなく、かつポリヌクレオチドが単球特異的ベクターを通してインビボで単球に導入される、請求項48、50、52、または59のいずれか一項記載の方法。
請求項61
請求項9、10、14、20、22、または28のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
請求項62
請求項29〜37のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
請求項63
請求項61記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項64
請求項62記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項65
単球特異的ベクターである、請求項63記載のベクター。
請求項66
請求項61記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
請求項67
請求項62記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
請求項68
哺乳動物細胞である、請求項66または67記載の宿主細胞。
請求項69
単球、マクロファージ、または泡沫細胞である、請求項66記載の宿主細胞。
請求項70
動脈平滑筋細胞、血管平滑筋細胞、または内皮細胞である、請求項66または67記載の宿主細胞。
請求項71
心筋細胞、冠動脈脂肪細胞、または心線維芽細胞である、請求項66記載の宿主細胞。
請求項72
請求項61または62記載のポリヌクレオチドを含む非ヒト生物。
請求項73
非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、またはモルモットである、請求項72記載の非ヒト生物。
請求項74
請求項9または10記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項75
請求項74記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクトする段階、およびPAI-1リガンドまたはポリリガンドポリペプチドの少なくとも1コピーを産生するために適した条件下でトランスフェクト宿主細胞を培養する段階を含む、PAI-1リガンドまたはポリリガンドポリペプチドを産生する方法。
請求項76
被験体の心組織に請求項74記載のベクターを注入する段階を含む、被験体の心組織におけるPAI-1を阻害する方法。
請求項77
以下を含む、アテローム性動脈硬化症を処置または予防するための方法：a）血管損傷を有するまたは血管損傷のリスクを有する被験体を同定する段階；b）被験体から単球を単離する段階；c）請求項74記載のベクターを単球にトランスフェクトして、改変細胞を産生する段階；およびd）改変細胞を被験体に導入する段階。
請求項78
以下の段階を含む、固定マクロファージ集団を伴う線維症状態を処置、予防、または改善するための方法：a）線維症状態を有するまたは線維症状態を発症するリスクを有する被験体を同定する段階；b）被験体から単球を単離する段階；c）請求項8または9記載のポリヌクレオチドが固定マクロファージ集団に特異的な調節エレメントに連結される、請求項74記載のベクターを単球にトランスフェクトして、改変細胞を産生する段階；d）改変細胞を被験体に導入する段階。
請求項79
請求項74記載のベクターを受精卵に注入する段階を含む、低減されたPAI-1活性を有するトランスジェニック被験体を作製する方法。